# Электронная микроскопия клеток и тканей: Замораживание- Скалывание- Травление

Я Ю Комиссарчик

Монография является первым (и по сей день единственным) отечественным руководством по анализу ультраструктуры клеток и тканей животных методом замораживания-скалывания-травления. В ней рассматриваются физические основы метода, препаративные аспекты и результаты его применения в цитологии и гистологии. В книге детально разбираются артефакты метода и вопросы интерпретации изобра╛жений с реплик замороженных и сколотых тканей и клеток. Большое место уделяется использо╛ванию метода замораживания-скалывания-травления в изучении биологических мембран, межклеточных контактов и внутриклеточных органоидов. Анализируются также перестройки основных клеточных элементов в процессе их функционирования и при воздействии различных агентов на клетку. Богатый иллюстративный материал книги является в большой степени ориги╛нальным. Монография рассчитана на цитологов, гистологов, биологов, а также на преподавателей, аспирантов и студентов, изучающих цитологию и гистологию. Библиогр. 552 назв. Ил. 13+32 вклей╛ки. Табл. 1. Полную версию с электронограммами можно скачать здаесь: ttps://yadi.sk/i/iTeNMxsO3Erq6y

Полную версию с электронограммами можно скачать здаесь:

ttps://yadi.sk/i/iTeNMxsO3Erq6y

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

Я. Ю. КОМИССАРЧИК, А. А. МИРОНОВ

Электронная микроскопия клеток и тканей: ЗАМОРАЖИВАНИЕ- СКАЛЫВАНИЕ- ТРАВЛЕНИЕ

Ответственный редактор П. П. РУМЯНЦЕВ

ЛЕНИНГРАД "НАУК А"

ЛЕНИНГРАДСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ 1990


Ja. Ju. Komissarchik, A. A. Mironov

ELEKTRON MICROSCOPY OF TISSUE AND CELLS: FREEZE-FRACTURING-ETCHING


УДК 57.086.13: 57.086.3

Комиссарчик Я. Ю., Миронов А. А. Электронная микроскопия клеток и тканей: замораживание-скалывание-травление. - Л.: Наука, 1990. - 143 с.

Монография является первым отечественным руководством по анализу ультраструктуры клеток и тканей животных методом замораживания-скалывания-травления. В ней рассматриваются физические основы метода, препаративные аспекты и результаты его применения в цитологии и гистологии. В книге детально разбираются артефакты метода и вопросы интерпретации изображений с реплик замороженных и сколотых тканей и клеток. Большое место уделяется использованию метода замораживания-скалывания-травления в изучении биологических мембран, межклеточных контактов и внутриклеточных органоидов. Анализируются также перестройки основных клеточных элементов в процессе их функционирования и при воздействии различных агентов на клетку. Богатый иллюстративный материал книги является в большой степени оригинальным. Монография рассчитана на цитологов, гистологов, биологов, а также на преподавателей, аспирантов и студентов, изучающих цитологию и гистологию. Библиогр. 552 назв. Ил. 13+32 вклейки. Табл. 1.


Полную версию с электронограммами можно скачать здаесь:

ttps://yadi.sk/i/iTeNMxsO3Erq6y


Editor-in-chief P. P. RUMYANTSEV

Corresponding Member of the Academy of Sciences of the USSR

Рецензенты: H. H. Никольский, Ю. В. Погорелое

No Я. Ю. Комиссарчик, А. А. Миронов, 1990

ISBN 5-02-026566-7


Оглавление


ВВЕДЕНИЕ


Создание в 30-х годах просвечивающего электронного микроскопа явилось крупнейшим по своему значению событием для развития цитологии и гистологии в XX в. Однако последующая практика его эксплуатации в исследовательских лабораториях убедительно показала, что прогресс в структурно-химическом анализе клеток и тканей б равной мере связан как с совершенствованием самого микроскопа, так и с успехами в разработке новых методов препарирования биологических объектов для электронной микроскопии.

Метод замораживания-скалывания-травления (ЗСТ) (Учитывая, что в процессе скалывания практически не удается избежать сублимации воды, в книге используется термин "замораживание-скалывание-травление" (ЗСТ).) был разработан в 1957 г. Старом [491]. Принцип метода достаточно прост: замороженные образцы тканей раскалывают, на обнажившиеся поверхности напыляют металл, полученную таким образом металлическую реплику очищают и изучают в просвечивающем электронном микроскопе. Исторически метод замораживания- скалывания (ЗС) создавался для анализа нативных биологических объектов, не измененных химической фиксацией. Первоначально биологические ткани фиксировались быстрым замораживанием без предварительной химической фиксации или обработки криопротекторами.

Большой вклад в развитие, совершенствование и популяризацию метода ЗС внес Мур с соавторами [345] - была создана коммерческая установка для ЗС, которая теперь широко известна, и налажен ее выпуск фирмой "Balzers" (Лихтенштейн).

Лишь со второй половины 60-х годов отмечается возрастание интереса ученых к данному методу, а к концу этого же десятилетия кривая роста числа публикаций по методу ЗС и его применению в морфологии резко поднимается. Однако уже в конце 70-х годов эта кривая начинает выходить на плато - метод становится уже широко распространенным и, по сути, рутинным. Со второй половины 80-х годов число публикаций с использованием метода ЗС стабилизируется, а в некоторых морфологических журналах даже снижается. Таким образом, в развитии данного метода условно можно выделить несколько этапов. Первый этап, от 1957 г. до второй половины 60-х годов, можно назвать периодом чисто технической разработки метода ЗС и замораживания-травления (ЗТ). В ходе данного периода были созданы две основные группы установок для ЗС - отдельный вакуумный прибор с криоультратомом Мура (установка типа "Balzers") и установка на базе вакуумного поста (типа установки Булливанта), которая имеет многочисленные варианты :в конструкции (подробнее см. [38]).

Второй этап развития метода ЗС характеризуется двумя основными тенденциями. Во-первых, интенсивно изучается механизм скола, в результате чего становится общепризнанным, что линия скола идет по гидрофобной области биологической мембраны. Одновременно развиваются и представления о строении самой мембраны. Современная модель строения мембраны (жидкостномозаичная) в значительной мере базируется на данных метода ЗС. Во-вторых, налаживание коммерческого выпуска и распространение специальных установок для этого метода приводит к росту публикаций, в которых излагаются данные, полученные на различных клетках и тканях. Необходимость унификации описаний получаемых на репликах картин потребовала создания специальной номенклатуры, которая и была успешно разработана в середине 70-х годов благодаря сотрудничеству наиболее известных специалистов из различных стран мира. Уже начиная со второй половины 60-х годов появляются первые обзоры данных, полученных с помощью метода ЗС. При этом, однако, преимущественное внимание уделяется технике препарирования, а не результатам и их интерпретации. В 70-х годах вопрос об интерпретации данных, получаемых методом ЗС, встал очень остро. Основным предметом научных дискуссий стала проблема внутримембранных частиц (ВМЧ). Следует сказать, что, хотя большинство ученых склоняется в пользу белковой природы ВМЧ, данную проблему нельзя считать окончательно решенной. Второе направление, привлекшее внимание ученых, - проблема слияния мембран. Дело в том, что только метод ЗС позволяет детально изучать структурные перестройки внутри мембран в ходе их слияния. Третье направление - изучение структуры, процесса образования и функций межклеточных контактов. Уже в первой половине 70-х годов появились обобщающие работы в этой области, среди которых выделяется наиболее обстоятельный обзор Стехелина [490], который не потерял актуальности до настоящего времени. Таким образом, второй этап развития метода ЗС характеризуется уже элементами зрелости: появились стандартная аппаратура и единая международная номенклатура, был четко идентифицирован механизм скола, сформулированы наиболее важные проблемы и направления, начат систематический анализ клеток и тканей, появились первые обзоры полученных результатов.

Третий этап, охватывающий пятилетие от второй половины до конца 70-х годов, характеризуется развитием метода ЗС преимущественно вширь. К концу этого этапа были описаны практически все органы и ткани, публикуется ряд монографий, среди которых выделяется книга Орчи и Переле [375], детально обсуждаются вопросы, связанные с проблемой слияния мембран.

В нашей стране в 70-х и начале 80-х годов были опубликованы три монографии [4, 21, 38], где в той или иной мере анализируются результаты изучения мембран с помощью ЗС. Появляются обобщающие работы по частным вопросам, например в нашей стране опубликованы большие обзоры, посвященные ультраструктуре мембран [5], межклеточных контактов [35] и эндотелиальных клеток [6]. Клетки и ткани широко изучаются не только в норме, но и при различных функциональных состояниях, экспериментальной и клинической патологии, в культуре ткани.

К концу 70-х годов в своем первоначальном варианте метод ЗС становится рутинным методом электронной микроскопии и начинается четвертый этап его развития. Отличительной особенностью этого этапа является дальнейшее совершенствование метода, повышение его информативности. В первую очередь здесь необходимо отметить создание Хьюзером [223, 226] способа сверхбыстрого замораживания (СЗ) и глубокого травления (ГТ), который значительно повысил информативность метода ЗС в изучении цитоскелета, цито-скелет-мембранных взаимоотношений, а также в анализе быстро протекающих биологических процессов (секреции, эндоцитоза, синаптической передачи и др.). После этого определенной ревизии подверглись и представления о строении межклеточных контактов. Однако до настоящего времени вследствие уникальности аппаратуры данная модификация еще не получила должного распространения. Быстро развиваются методы сочетания ЗС с цитохимией. Эти подходы позволяют проводить, по существу, биохимическое картирование мембран.

Следует, однако, отметить, что в то время как во всем мире метод ЗС стал рутинным методом исследования, в СССР имеется лишь несколько центров, где ученые продуктивно используют данный метод анализа. Впервые в нашей стране метод ЗС был использован в работах исследователей из Института биологической физики АН СССР (г. Пущино; В. Л. Боровягин, Б. Л. Аллахвердов и др.), Института физиологии микроорганизмов АН СССР (г. Пущино; Б. А. Фихте, Э. И. Заичкин), Института цитологии АН СССР (г. Ленинград; Я. Ю. Комиссарчик). В этих институтах были разработаны достаточно простые лабораторные установки. Хотя ученые из г. Пущино достигли большого прогресса в деле разработки аппаратуры для ЗС, она до сих пор серийно в СССР не выпускается (в настоящее время почти вся имеющаяся в нашей стране аппаратура либо импортная, либо самодельная); несомненна заслуга этих ученых также и в организации регулярных всесоюзных симпозиумов "Криогенные методы в электронной микроскопии".

Причины отставания данного направления в СССР обусловлены отсутствием соответствующего аппаратурного парка и слабой информированностью отечественных гистологов и цитологов о возможностях метода ЗС. На момент написания данной работы в учебниках и атласах по гистологии, изданных в СССР, не было ни одной фотографии, полученной с помощью этого метода. Именно поэтому в задачу монографии входило систематическое изложение технических аспектов метода ЗС, результатов, полученных с его помощью, а также их обсуждение в свете современных моделей строения мембран и контактов, моделей процесса слияния мембран. Мы не рассматривали в монографии информацию, полученную на модельных мембранах, на прокариотах, а также на растительных объектах. В основу книги было положено описание изображений животных клеток и тканей.

Данную работу мы рассматриваем как своеобразный каталог данных, касающихся внутреннего строения биомембран различных клеток, тканей и органов млекопитающих, т. е. как введение во внутримембранную гистологию. По большинству из написанных глав монографии авторы являются специалистами, и по многим вопросам представлен собственный материал. Часть разделов написана только на основании литературных данных (это относится главным образом к органам чувств и половым органам). (Здесь мы должны поблагодарить фирму "Balzers" и господина Бёлераза любезное предоставление в наше распоряжение десяти томов исключительно полных библиографических подборок по методу ЗСТ до 1981 г. включительно.)

Попытка свести воедино все данные о внутреннем строении мембран в клетках и тканях организма является, по-видимому, первой и последней, так как быстро растущий поток публикаций сделает через несколько лет новую такую попытку неосуществимой.

Особое внимание мы уделили библиографии и постарались собрать всю основную литературу по проблеме мембранной гистологии, что должно облегчить читателю использование данной книги в качестве своеобразного справочника по методу ЗСТ.

Наряду с изложением технических аспектов, одной из главных задач, стоящих перед нами, была критическая оценка и обобщение достижений последних десятилетий, формулирование нерешенных проблем и наиболее перспективных направлений в развитии интрамембранной морфологии. Несомненно, что необходимость в книге, подобной данной, вполне назрела, и пришло время подвести итоги более чем 25-летних исследований, выполненных учеными разных стран мира. Она будет способствовать появлению большего интереса к проблеме интрамембранной гистологии и в первую очередь в нашей стране, где пока метод и связанные с ним проблемы не очень популярны. Мы стремились также дать преподавателям гистологии и цитологии краткое руководство по методу ЗС. Представленные микрофотографии, большая часть которых получена авторами в ходе собственных исследований, снабжены подробными комментариями. Для пояснения механизма сколов и современных моделей строения мембран и контактов в книге широко используются схематические рисунки. Тем не менее читатели должны иметь базовые знания по гистологии, так как в тексте не дается расшифровки строения известных клеточных и тканевых структур.

Некоторые главы данной работы написаны в соавторстве с В. А. Мироновым, Г. А. Алимовым, Е. С. Снигиревской.

Авторы будут благодарны за все критические замечания по поводу книги и сочтут свою задачу выполненной, если появление данного труда будет способствовать прогрессу морфологических исследований в нашей стране.

В заключение авторы выражают искреннюю благодарность сотрудникам группы ультраструктуры клеточных мембран Института цитологии АН СССР (г. Ленинград) Л. В. Кевер, Е. В. Королеву, В. И. Романову, коллегам из экспериментально-морфологической группы центральной научно-исследовательской лаборатории Ивановского государственного медицинского института им. А. С. Бубнова М. Д. Рехтеру, С. Л. Вялову, В. А. Тарасову, сотруднику лаборатории электронной микроскопии и микроциркуляции межфакультетского лабораторного комплекса 2-го Московского государственного медицинского института им. Н. И. Пирогова В. Б. Суслову за предоставление и помощь в получении иллюстративного материала (Ряд электронно-микроскопических фотографий был любезно предоставлен нашими коллегами.), полезное обсуждение ряда вопросов по теме данной книги и помощь в подготовке рукописи. От всего сердца благодарим В. С. Гринько, Е. А. Тихомирову и В. А. Колпакова за помощь в подготовке рукописи и рисунков.


СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АДГ - антидиуретический гормон

АМФ - аденозинмонофосфат

ВМЧ - внутримембранные частицы

ГЛ - гликолипиды

ГМК - гладкомышечные клетки

ГП - гликопротеины

ГТ - глубокое травление

ДСД - дигитонин-стероловые деформации

ДСК - дигитонин-стероловые комплексы

ЗС - замораживание-скалывание

ЗТ - замораживание-травление

ЗСТ - замораживание-скалывание-травление

ИП - интегральные протеины

К - митохондриальные кристы

КО - круговое оттенение

Кр - коэффициент распределения

КФ - контактная фибрилла

М - митохондриальный матрикс

МТ - микротрубочки

МФ - микрофиламенты

СЗ - сверхбыстрое замораживание

СЗ-ГТ-КО - сверхбыстрое замораживание - (скалывание) - глубокое травление-круговое оттенение

ФСД - филипин-стероловые деформации

ФСК - филипин-стероловые комплексы

ЦНС - центральная нервная система ЦПС - цитоплазматическая сеть ЩК - щелевой контакт ЭПР - электронопарамагнитный резонанс

ЭФР - эпидермальный фактор роста

Я - ядро ЯМР - ядерномагнитный резонанс ЯП - ядерная пора

EF-поверхность - экстрацеллюлярная поверхность скола

ES-поверхность - экстрацеллюлярная поверхность мембраны

PF-поверхность - протоплазматическая поверхность скола

PS-поверхность- цитоплазматическая поверхность мембраны


## Глава 1

. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАМОРАЖИВАНИЯ

Перед началом изложения отметим, что в настоящей работе мы сознательно избегали применения ряда латинизированных терминов (например, криофрактография), предложенных Б. А. Фихте с соавторами [38] для обозначения комплекса методов, основными этапами которых являются быстрое замораживание образца, скалывание в замороженном состоянии, некоторые дополнительные процедуры и изготовление оттененного "слепка" с поверхности полученного скола. Считаем, что с тем уровнем развития данного метода, который имеется в нашей стране, и в связи с редким его использованием в отечественных исследованиях нам еще рано выступать в роли законодателей терминологии. Названия методов приведены в русском переводе. Использование криогенных методов в электронной микроскопии, естественно, шире очерченной группы, поэтому очень важно установить критерии для отнесения метода в данную совокупность: 1) быстрое замораживание, 2) раскалывание в замороженном состоянии и 3) изготовление реплики (как правило, угольно-металлической) с полученной или модифицированной затем поверхности (рис. 1).

Разнообразие методов ЗС определяется модификациями режимов основных этапов препарирования или добавлением к ним некоторых дополнительных процедур. В этой связи в настоящее время различают следующие нерезко ограниченные группы методов исследования: замораживание-скалывание (freeze-fracturing, или freeze-cleaving), замораживание-скалывание-травление, которое чаще называют замораживание-травление (freeze-etching), сверхбыстрое замораживание-скалывание-глубокое травление, которое, как правило, обозначают как быстрое замораживание-глубокое травление (quick freezing-deep etching). Каждый из этих методов может быть модифицирован и обладает своими особыми возможностями, которые необходимо знать и учитывать при выборе метода, адекватного поставленной задаче. Весьма важно также иметь представление о процессах, происходящих в образце на разных этапах его препарирования, с тем чтобы интерпретация получаемых результатов была более уверенной и объективной.

Исторически метод ЗСТ создавался как идеальный безартефактный метод препарирования для электронной микроскопии, не требующий какой-либо химической обработки образца и способный "мгновенно" зафиксировать его ткани в том или ином состоянии. Практика не подтвердила идеальности метода и показала, что ему свойственны свои артефакты и ограничения. Вместе с тем оказалось, что сами эти методы дают принципиально новую информацию о структуре изучаемого образца, благодаря чему возможности электронной микроскопии значительно расширяются.

Становление метода связано с именами Стира и Мура. Исходя из работ по репликации поверхности замороженных образцов эти исследователи впервые объединили в рамках одного метода процессы замораживания образца, скалывания его в замороженном состоянии и изготовление реплики с полученного скола [345, 491]. В это же время были начаты работы по приборному обеспечению метода, расшифровке полученной информации и исследованию самих процессов замораживания и скалывания [345]. В результате было установлено, что процесс замораживания биологических образцов является важнейшим этапом всей препаровки. Его сложность и многоступенчатость связаны с много-компонентностью любого из образцов и с различием тетиператур перехода этих компонентов из обычного состояния в замороженное. Некоторые компоненты, например вода, при различных скоростях охлаждения переходят в разные состояния, отличающиеся конечной структурой и занимаемым объемом.

Рис. 1. Схема основных этапов метода ЗСТ.

А - раскалывание в вакууме; Б - раскалывание под слоем сжиженного газа; В - раскалывание в атмосфере сухого газа. 1-2 - подготовка образца к замораживанию: нефиксированные препараты (1), фиксация с использованием криопротектора (2); 3 - замораживание; 4 - скалывание; 5 - травление; 6 - оттенение; 7 - растворение ткани; 8 - снятие реплики; 9 - просмотр в электронном микроскопе.

1.1. ЗАМОРАЖИВАНИЕ

Остановимся очень кратко на физических закономерностях, лежащих в основе процесса замораживания образца. Замораживание стабилизирует биологические образцы, но в то же самое время может существенно их повреждать. Это обусловлено кристаллизацией воды, которая разрушает клеточные структуры. Можно выделить три состояния замороженных кусочков: 1) образовавшийся лед имеет макрокристаллический характер (кристаллы размером более 3 нм), 2) образование микрокристаллов льда (2-3 нм), 3) аморфное состояние льда (электронно-микроскопически кристаллы не определяются). Для большинства электронно-микроскопических исследований первое состояние неприемлемо из-за повреждения ультраструктур. Для практических целей достаточно достижения второго состояния. С физической точки зрения, только аморфное состояние льда отвечает идеальной криофиксации, а образец может быть назван витрифицированным.

Достигаемое состояние определяется скоростью охлаждения, которая в свою очередь лимитируется тремя факторами: 1) теплоемкостью образца, 2) теплопроводностью воды и 3) скоростью отвода потока тепла от препарата [6. 344]. Очевидно, что в биологических исследованиях может быть изменен только последний параметр, поскольку замена воды другим растворителем резко меняет свойства биологических мембран, приводя к потере многих возможностей метода ЗС. Теоретически скорость отвода тепла от поверхности образца может достигать 1012°С/с и более. Однако с увеличением расстояния от поверхности скорость охлаждения падает. На глубине 100 нм максимально достижимая скорость охлаждения составляет не более 109°С/с. На расстоянии 10 мкм величина этого параметра падает до 10°С/с. Однако на практике эти цифры существенно ниже. Чистая вода для достижения состояния витрификации требует скорости охлаждения 106°С/с, а толщина слоя, в котором этот эффект будет обеспечен, составит не более 100 нм. Клетки и ткани требуют скорости охлаждения не менее 104°С/с и могут быть удовлетворительно криофиксированы в слое не толще 10 мкм. В то же время если такие образцы защитить криопротекторами, то требуемые скорости не превышают 100°С/с, а достижимая глубина витрификации будет равна 1000 мкм.

Проверка этих положений показала, что, например на заднем эпителии роговицы, при обычной препаровке кристаллы льда начинают формироваться уже на глубине 3 мкм. Скорость охлаждения 6000-10 000°С/с предотвращала образование льда в цитоплазме, но в вакуолях он формировался даже на глубине 1 мкм, где скорость охлаждения достигает 10 000°С/с [344].

Величина образующихся кристаллов зависит от длительности периода, когда температуры образца находятся между точкой замерзания воды и точкой витрификации. Можно выделить на этой основе три различных способа достижения точки витрификации: 1) медленное замораживание, 2) быстрое замораживание, 3) сверхбыстрое замораживание [6].

Если температура образца после достижения точки замерзания снижается медленно, механизм "суперохлаждения" действует до точки, при которой примеси начинают играть роль ядер кристаллизации. Этот тип кристаллообразования называют гетерогенным. Кристаллы льда образуются крупные, поскольку число ядер кристаллизации лимитировано. В это время идет выделение тепла кристаллизации, которое нагревает систему до точки замерзания. Дальнейшее снижение температуры возможно лишь после того, как вода полностью трансформируется в лед. Если скорость отвода тепла больше, чем скорость его выделения, то рост кристаллов уменьшается. При температуре -40°С система входит в зону гомогенной кристаллизации, когда каждая молекула воды становится потенциальным центром кристаллизации. Поскольку таких центров очень много, размеры кристалликов лимитированы. Зона температур и скоростей отведения тепла, характеризующая переход от медленного к быстрому замораживанию, называется критической [344].

Было обнаружено, что слой воды толщиной менее 100 нм может быть охлажден без выявляемой методом дифракции электронов кристаллизации. Однако если образец нагреть до температуры девитрификации (превращения воды из стеклообразного состояния в лед), то может начаться рост кристаллов. Иными словами, возможен такой уровень отведения тепла, который позволяет заморозить воду в аморфном состоянии. Следовательно, когда мы понижаем температуру образца ниже точки плавления, скорость роста кристаллов льда достигаетмаксимума, а затем (при дальнейшем охлаждении) медленно снижается вследствие увеличения вязкости воды. Когда достигается температура девитрификации, вязкость воды становится настолько высокой, что движение ее молекул резко ограничивается и соответственно рост кристаллов прекращается. В чистой воде зона кристаллизации расположена в температурном интервале от 0 до - 133°С. Величина интервала зависит от содержания воды в биологических объектах. В физиологически активных клетках этот интервал простирается от -2 до -80°С, в морозостойких клетках, где содержание воды уменьшено, зона кристаллизации находится между -13 и -43°С. В сухих зернах, спорах и в пыльце, где не остается свободной воды, зона кристаллизации отсутствует. Быстрое и сверхбыстрое замораживание позволяет фиксировать ткани в состоянии, близком к естественному. В этом случае практически не возникает осмотического повреждения и преципитации белков [344].

В большинстве используемых методик считается достаточным достижение скорости понижения температуры больше 500°С/с, что обеспечивается приведением образца в контакт с глубоко охлажденными жидкостью или гладкой металлической (чаще медной, золотой или серебряной) поверхностью. Сжиженные газы (особенно азот) для этих целей неприемлемы. Они испаряются под действием охлаждаемого образца и окутывают препарат слоем газа (газовой "шубой"), что резко ухудшает теплоотвод (Если жидкий азот перевести в замороженное состояние, охладив его дополнительно (например, за счет вакуумирования, а затем быстрого срыва вакуума), то процесс замораживания в нем идет почти так же, как и при использовании промежуточной среды. Теоретически и экспериментально обосновано также применение для замораживания азота, находящегося под давлением, на 4•103 кПа превышающим критическое. Температура азота при этом близка к точке плавления. Теоретически в этом случае можно достичь скорости охлаждения 10000°С/с [415].). Данный эффект предупреждается путем использования промежуточных жидкостей - гидро- и флюорокарбонов (фреонов, изопренов и других, пропан наиболее предпочтителен), которые предварительно охлаждаются в жидком азоте, кислороде или гелии [481-483]. На практике чаще всего используют погружение образца во фреон-22, охлаждаемый в жидком азоте и имеющий при нормальном атмосферном давлении температуру плавления -160°С. Большие скорости охлаждения (1000-10000°С/с) достижимы при использовании жидкого гелия [6, 217, 483]. Однако эта техника сложна, плохо воспроизводима и не нашла широкого применения.

При использовании промежуточной среды с широким интервалом между точками замерзания и кипения образование неперемешивающегося слоя жидкости на поверхности кусочка действует как барьер на пути теплоотдачи. Перемешивание кусочков уменьшает толщину пограничного слоя и ускоряет охлаждение. С этой же целью применяется быстрая струя охлажденной промежуточной жидкости. Обычно для этих целей используется жидкий пропан, который имеет точку замерзания -189°С, а при охлаждении жидким азотом до -196°С он еще сохраняет жидкое состояние в течение 3-5 мин [6].

На практике метод сверхбыстрого замораживания (СЗ) образца с применением тщательно отполированного металлического стержня обычно реализуется следующим образом. Стержень охлаждают жидким гелием. Затем на короткое время он появляется над поверхностью, касается полированным концом поверхности тканевого образца и, оторвавшись от него, вместе со слоем примороженной ткани снова погружается в жидкий гелий. Направление скалывания выбирается таким образом, чтобы нож прошел в непосредственной близости от поверхности стержня, где скорость замораживания тканевого образца максимальна. Кристаллы льда в образце не обнаруживаются до глубины 5-12 мкм. В связи с тем что техническое осуществление этого способа очень сложно, он пока не нашел достаточного распространения. Использование для охлаждения блока жидкого азота является компромиссным вариантом [9]. Разработан сравнительно недорогой и простой прибор для подобной криофиксации, где стержень охлаждается жидким азотом. Кристаллы льда при его использовании не обнаружены на глубине до 10 мкм [49]. Более подробное описание технических устройств, применяемых для реализации метода ЗСТ, можно найти в книге Б. А. Фихте с соавторами [38].

Вторым способом уменьшения температурного интервала, в котором происходит кристаллизация льда в образцах, является уменьшение количества воды в образце либо с помощью высушивания, либо путем замещения воды глицерином (или другими криопротекторами: диметилсульфоксидом, моно- и дисахаридами и др.). Однако в случае нефиксированных образцов, как будет показано ниже, этот метод не годится, так как ведет к возникновению артефактов.

Если нет возможности использовать криопротекторы, то одной из возможных альтернатив является замораживание под давлением. Данный метод позволяет уменьшить критический уровень охлаждения в 100 раз и сохранить интактную структуру тканей в поверхностном слое толщиной 150 мкм. Если охлаждение образца осуществляется между двумя металлическими поверхностями, то толщина слоя ткани, где происходит витрификация воды, может достигать 600 мкм [343, 344] . Использование замораживания под высоким давлением основано на принципе Ле Шателье. Как известно, замораживание приводит к увеличению объема воды, а высокое давление мешает его возрастанию, тем самым предотвращая кристаллизацию. Эффект реализуется путем снижения точки замерзания и уменьшения уровня нуклеации и роста кристаллов. Из-за редукции выделения кристаллизационного тепла требуется меньшая скорость его отведения. Другими словами, скорость охлаждения, требуемая для обеспечения витрификации воды, будет снижена. Фирма "Balzers" уже начала выпуск коммерческих аппаратов для замораживания под давлением. В их конструкции удалось решить проблемы, связанные как с поддержанием сверхвысокого давления, так и с безопасностью, воспроизводимостью, удобством в работе. Принцип действия данного аппарата заключается в том, что насос захватывает жидкий азот и под давлением впрыскивает его в камеру для охлаждения, где струя при контакте с образцом испаряется. Однако выпуск газа ограничен, что позволяет достичь в камере давление порядка 2.07•105 кПа. Удалось решить и такие технические проблемы, как синхронность повышения давления и замораживания (если давление повысится до момента замерзания образца, то это может привести к гибели клетки, если же раньше произойдет замерзание, то исчезают преимущества метода). Оптимальный уровень давления был определен на основе фазовой диаграммы и проверен экспериментально [344].

При указанном выше давлении точка плавления снижается до -22°С, а зона суперохлаждения до -90°С. Вода при таком высоком давлении кристаллизуется не в виде льда I типа, т. е. при более низкой плотности, чем вода, а в виде льда II и III типа с большей плотностью, чем жидкая фаза. Кроме того, в этих условиях тепло может быть отведено от образца в стадии суперохлаждения до тех пор, пока температура не достигнет -90°С. Даже если кристаллизация начнется, она будет идти очень медленно. Однако если после снятия давления температуру образца повысить от -196°С до -143-128°С, тр начинается образование льда типа I и кусочки ткани разрываются [344]: В срезах печени [349], коры головного мозга [343], хряща [237], замороженных под давлением, не обнаружено кристаллизационных артефактов до глубины 600 мкм.

Поскольку поверхностная зона образца охлаждается быстрее, чем центральная, размеры образца имеют исключительно важное значение. Существенное их уменьшение также является одним из выходов при данной ситуации. Однако соображения структурной целостности и сохранения пространственных отношений тканевых компонентов накладывают здесь определенные ограничения [6].


При исследовании суспензий клеток и органелл размеры образцов легко уменьшить до 10 мкм, их можно быстро заморозить, разбрызгивая раствор пульверизатором на отполированную поверхность охлажденного металлического блока [105, 108, 109].

1.2. КРИОПРОТЕКТОРЫ

В связи с ограничениями в уменьшении размеров образцов в процессе развития метода ЗСТ для улучшения процесса замораживания (в условиях, когда коммерческих аппаратов для замораживания под давлением не существовало) пришлось идти по пути воздействия на имеющуюся в образцах свободную воду. В большинстве исследований при замораживании тканевых образцов, обводненных более чем на 50-60%, чаще всего используют химический способ уменьшения количества свободной воды с помощью криопротекторов. В качестве последних обычно используют глицерин, но приемлемы и другие органические вещества (например, диметилсульфоксид и сахароза), молекулы которых, проникая в образец, активно структурируют воду, взаимодействуя с ней.


## Глава 2

(Глава написана в соавторстве с Г. А. Алимовым.). МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ИЗОБРАЖЕНИЙ


Обычно стандартная процедура подготовки образца для криоскалывания состоит из трех этапов: химической префиксации образца, его пропитывания криопротектором и быстрого замораживания в охлажденном фреоне или пропане. Результаты этой процедуры вполне удовлетворительны, и она нашла самое широкое распространение из-за своей простоты и общедоступности.


2.1. ЭТАПЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ

Префиксация. Кратковременная химическая префиксация образца практически полностью предотвращает возникновение большинства артефактов, связанных с криопротекторами. При этом глютаральдегид дает наилучший профилактический эффект, особенно при температуре тела животного; можно использовать и формальдегид [179]. Однако сам факт использования химической префиксации образца, предназначенного для последующей физической фиксации замораживанием, лишает идею физической (холодовой) фиксации ее основных достоинств: мгновенности действия и возможности сохранить ткань в нативном состоянии без какой-либо химической обработки. Успешное развитие различных способов СЗ, о которых говорилось выше, позволяет решить эту проблему [6].

Раскалывание. Вода в замороженном образце находится в витрифицированном состоянии, поэтому следующий этап препарирования связан с его скалыванием. Следует заметить, что после замораживания образцы могут годами храниться в жидком азоте. Все методы раскалывания, используемые для ЗСТ, в зависимости от условий можно разделить на четыре большие группы: 1) раскалывание в вакууме, 2) раскалывание в условиях сверхвысокого вакуума, 3) скалывание образца вне испарителя под сжиженным газом, 4) раскалывание в атмосфере сухого газа [6].

Способов собственно скалывания много, но все они сводятся к разрыву, разламыванию или срезанию (хотя, по существу, механизм скалывания здесь один и тот же) замороженного образца [6]. Достоинством первых двух способов является то, что они дают сразу две комплементарные поверхности скола [20]. В ряде экспериментов это достоинство оказалось определяющим для трактовки полученных результатов [108]. Были разработаны конструкции, позволяющие получать реплики с обеих поверхностей скола [6, 38]. Первый способ оказался особенно полезным при исследовании монослойных культур и при ЗС суспензий однородных по размерам сферических частиц [481]. Однако у этого способа скалывания имеется и ряд недостатков. К их числу относятся: непредсказуемость среднего направления поверхности скола в образце, большие отклонения локальных направлений скола от среднего и преимущественная локализация скола в центральной зоне образца, где условия его замораживания наихудшие. Все это ухудшает качество самих реплик.

Важным достоинством скалывания под слоем сжиженного газа является относительная техническая простота и возможность использования в сочетании со многими вакуумными напылительными установками, изначально неприспособленными для ЗС. Применение жидкого гелия позволяет обеспечить скалывание при самой низкой из возможных температур и минимизировать деформации. Основная сложность этих способов в необходимости обеспечить надежную защиту поверхности скола во время его перенесения из-под слоя сжиженного газа в вакуумную камеру и при получении вакуума в ней. Эта задача успешно решается с помощью системы глубоко охлажденных металлических экранов, которые убираются при напылении реплики на поверхность скола или имеют специальные каналы для обеспечения этого процесса. В последнем случае экраны выполняют роль дополнительной низкотемпературной ловушки и при удачной конструкции способны улучшить вакуум в районе скола до величины порядка 10-11 Па [483].

Срезание образца лишено указанных недостатков. Среднее направление скола в этом случае задается направлением движения ножа, а поверхность может быть сформирована в непосредственной близости от поверхности образца, где скорость его замораживания много выше, чем в центре. Степень локальных отклонений поверхности скола от среднего направления также можно регулировать, если изменять скорость резания. Качество реплик, получаемых при срезывании больших площадей образца, в среднем значительно выше, особенно при использовании специальной микротомной техники [6].

Вместе с тем нож при своем движении может касаться поверхности формирующегося скола и вызывать нежелательные изменения его структуры как в результате чисто механического воздействия, так и локального разогрева фрикционным теплом. Быстрое разрушение режущей кромки ножа, ведущее к увеличению количества артефактов, накладывает определенные ограничения на число повторных срезываний замороженного образца, поэтому сейчас предпочитают конструкции с двумя лезвиями. Стружки, образующиеся в результате повторных срезываний, также могут ухудшать качество формирующейся поверхности скола, загрязняя ее и значительно повышая давление паров воды над ней. Кроме того, продолжительное микротомирование способствует откалыванию образца от объектодержателя. Наконец, срезывание позволяет исследовать лишь одну поверхность скола препарата, поэтому для решения некоторых задач оно оказывается неприемлемым.

Теоретически при низкой температуре как методы скалывания, так и микротомирования должны вести к получению идентичных сколов, обусловленных

топографией гидрофобных зон биомембран. Однако на практике получались

не совсем одинаковые результаты. Специальное исследование этого вопроса

позволило продемонстрировать, что при микротомировании поверхности разлома получаются при температуре ниже -70°С. Выше этой температуры

происходит истинное резание. Поэтому реплики, получаемые в микротомных

устройствах для ЗСТ, являются суммарным результатом нескольких последовательных расколов.

Несмотря на указанные выше недостатки, наиболее распространено сейчас ЗС с помощью микротомного устройства в вакууме. Наиболее часто применяется аппарат, выпускаемый фирмой "Balzers". При использовании этой аппаратуры замороженный образец переносят под защитой холодового экрана в вакуумную камеру и монтируют на предварительно охлажденный предметный столик. Поверхности скола в образце получаются в условиях высокого вакуума с помощью металлического лезвия, смонтированного на охлаждаемом жидким азотом микротоме, который имеет приспособления как для механической, так и для термической подачи. Резание (скалывание) осуществляется при любой температуре образца вплоть до -183°С. Реплика может наноситься на плоскость разлома либо немедленно после последнего скалывания, либо после определенного периода времени травления. В основном та же конструкция реализована и в других аппаратах данного типа. Отличия касаются лишь таких деталей, как использование, например, возвратно-поступательного движения ножа или двух ножей (для предварительного и окончательного скалывания) [6, 38, 482, 483].

Поскольку вакуумные криомикротомы довольно дороги и не всегда доступны для ряда лабораторий, предложены различного рода простые устройства и модификации на базе вакуумных постов, позволяющие на дешевом оборудовании получать неплохие результаты ([20, 38, 422] и др.). Чаще всего они используют принцип холодного блока, предложенный Булливантом [104, 109, 110]. В случае применения техники холодного блока замороженный образец помещают внутрь предварительно охлажденного в жидком азоте или гелии массивного металлического блока и переносят в вакуумную камеру. После достижения высокого вакуума с помощью различных приспособлений (за счет силы тяжести, рычага и т. п.) производится скалывание образца и через узкие каналы немедленно осуществляется напыление платины и угля. Скалывание может осуществляться вне вакуумной камеры под слоем жидкого азота. В этом случае требуются специальные меры защиты поверхности скола во время переноса блока в вакуумную камеру (например, перенос в емкости с жидким азотом). После испарения азота сразу же производится оттенение. Преимуществами данной методики кроме простоты, доступности, удобства приготовления комплементарных реплик является меньшая выраженность препарационных загрязнений. Однако поскольку с помощью подобных приспособлений трудно обеспечить необходимую локализацию скола, то нефиксированные образцы обычно не применяются. Методы раскалывания под слоем сжиженного газа (азота, гелия) также успешно развивались. Были созданы простейшие устройства для этой цели, где для получения одиночных поверхностей скола образец со своим держателем монтировался на пластину, погруженную в жидкий азот, и скалывался холодным лезвием. Предложены устройства для получения подобным образом комплементарных реплик и скалывания образцов под жидким азотом [38, 109].

Метод скалывания образца при атмосферном давлении под слоем жидкого гелия с последующей транспортировкой его в контейнере с жидким азотом успешно реализован в несложном устройстве. Вследствие своей дешевизны данная методика оказывается предпочтительнее, чем сверхвысоковакуумные аппараты. Разработаны и другие методы ЗС при сверхнизких температурах [38, 483].

Техника скалывания замороженных образцов в сухой атмосфере была реализована на базе криотомов, но в настоящее время из-за возможности конвекционных тепловых повреждений применяется редко. Скалывание обычно проводится в атмосфере паров жидкого азота, не содержащих воды. Сколотые образцы потом переносятся в жидкий азот, так что каких-либо существенных преимуществ данная методика не имеет [6, 38, 482].

Наиболее современной и перспективной модификацией метода ЗСТ является техника сверхбыстрого замораживания и глубокого травления (СЗ-ГТ), впервые предложенная Хьюзером [223, 226]. СЗ позволяет зафиксировать ткань в нативном состоянии, а ГТ хорошо визуализирует пространственную организацию ткани и дает возможность изучения цитоскелета клеток. Этот метод в сочетании с круговой репликацией позволил получить уникальные результаты о трехмерной организации большинства надмолекулярных и даже молекулярных структур клетки [225, 230].

В процессе раскола замороженного образца очень часто возникает задача получить скол, проходящий через структуру небольшой толщины определенным образом. Так, для скалывания биологических взвесей одним из наиболее эффективных оказалось простое приспособление в виде никелевого экрана с отверстиями определенного размера, который располагается между двумя пластинами разрывного устройства. Подбирая величину отверстий, можно добиться, чтобы клетки или полностью выступали над линией скола, проходящей, как правило, рядом с поверхностью никелевого экрана, либо над экраном были бы видны лишь верхушки клетки [381]. Для скалывания вытянутых структур, например нервных волокон, применяются держатели образцов с канавками, куда укладывается волокно [384]. Кроме того, перспективным подходом для целей ориентации скола представляется также использование неодинакового электростатического заряда на противолежащих сторонах раскалываемого объекта.

Описан метод получения EF-поверхностей скола плазмалеммы монослойных клеточных пластов с использованием стекол, покрытых поли-Ь-лизином, на котором и остается слой клеточных мембран [158].

Травление. Оттенение поверхности скола осуществляется или сразу же после ее обнажения (метод ЗС), или после проведения некоторых дополнительных операций. Наиболее распространенной из этих операций является сублимационное удаление льда с поверхности скола, называемое вакуумным травлением. Это наиболее мягкое воздействие на изучаемый образец, которое позволяет в основном удалять свободную, структурно не связанную воду из слоя образца, прилежащего к поверхности скола. Эффективность такого удаления зависит от температуры образца, глубины поддерживаемого вакуума и, безусловно, от количества свободной воды. В наибольшей степени скорость травления зависит.от температуры и при температурах -ПО, -100, -90, -80 и -70°С составляет соответственно 0.2, 1.5, 10, 50 и 250 нм/с [6, 86].

Глубина вакуума в меньшей степени влияет на эффективность вакуумного травления. Однако для надежного обеспечения чистоты протравливаемой поверхности давление в вакуумной камере целесообразно поддерживать более низким, чем давление насыщенных паров воды, которое при температурах - 120, -100 и -80°С равно соответственно 3•10-5, 1•10-3 и 5•10-2 Па [86]. Очень хороший эффект дают низкотемпературные вымораживающие ловушки, располагающиеся в непосредственной близости от поверхности скола. Эффективность их повышается по мере приближения к образцу и с понижением их собственной температуры. В установках фирмы "Balzers", снабженных замораживающим микротомом Мура, в качестве ловушки удобно использовать нож микротома, который имеет температуру около -185°С и может быть приближен к поверхности скола на расстояние до нескольких микрометров [6].

Различают два вида травления ("etching"): 1) тонкое травление материала, защищенного криопротектором, которое приводит к удалению маленьких кристаллов льда и придает травленой поверхности гранулярный вид; 2) глубокое травление либо фиксированных образцов, выдержанных в дистиллированной воде или в разбавленном буфере, либо интактных препаратов. Второй способ позволяет обнажать истинные поверхности мембран и внутренних структур клеток и тканей. Глубокое травление достигается двумя путями: 1) скалывание производится при низкой температуре или под слоем сжиженного газа, а затем образец нагревается до -100°С; 2) сначала повышается температура образца, он скалывается и подвергается травлению [109]. Температура -100°С применяется для травления в большинстве рутинных исследований, поскольку она находится ниже точки рекристаллизации льда в цитоплазме. Время травления обычно не превышает 2-5 мин. Удаление воды с поверхности скола позволяет получить дополнительную информацию о его внутренней структуре [9, 452].

Другая операция, химическое удаление материала с поверхности скола - химическое травление, в настоящее время применяется редко. Это более жесткое воздействие на поверхность скола, и оно способно удалять вполне определенные компоненты изучаемого образца. Основной особенностью этого воздействия является то, что химические реакции, экстрагирующие материал с поверхности скола, необходимо проводить при очень низких температурах. Это ведет к необходимости очень длительных экспозиций травления и накладывает ряд ограничений на экстрагирующий реактив, который должен быть жидким при этих температурах. Примером химического травления может служить экстрагирование липидов с поверхности скола с помощью диэтилэфира, проводимое при температуре сухого льда (-78,6°С). Эта процедура в настоящее время практически не используется.

Оттенение. Заключительным этапом, общим для всех модификаций метода ЗСТ, является изготовление реплики - слепка с поверхности скола. Этот этап чрезвычайно важен в том отношении, что практически полностью определяет разрешающую способность метода. Визуализация деталей поверхности скола осуществляется путем их оттенения тяжелым металлом (обычно платиной), термически распыляемым на реплицируемую поверхность в условиях глубокого вакуума (порядка 1.33•10-4 Па). Металл наносится под углом к поверхности скола и поэтому оттеняет все детали. При этом возникает система теней, отражающих высоту и форму структурных деталей скола, что и определяет контрастность формируемой реплики и ее разрешение. Качество всех этих параметров реплики зависит от электронной плотности напыляемого металла и толщины напыленного слоя, а также от угла к поверхности, под которым проводилось напыление. Однако такой слой чрезвычайно тонок (составляет примерно 2-3 нм) и механически непрочен. Поэтому перпендикулярно поверхности скола наносится слой углерода или другого материала, обладающего большой прочностью и малой контрастностью (толщиной в несколько десятков нанометров). Второй слой закрепляет первый, информационный слой и придает всей реплике механическую прочность. Иногда для простоты оба этих материала в определенных пропорциях напыляют на поверхность скола одновременно. Полученная угольно-платиновая пленка, называемая репликой, несет в себе всю информацию о структуре скола и может изучаться в электронном микроскопе [6].

Описанная процедура репликации практически общепринята и определяет хорошую разрешающую способность препарирования, составляющую примерно 2 нм. Получающиеся реплики обладают высоким контрастом, дают выпуклые рельефные изображения сколов и обеспечивают однозначную интерпретацию этих изображений.

Однако этот способ репликации не является единственным. Очень эффективным его вариантом является метод оттенения с вращением [314], при котором сколотый замороженный образец во время напыления на него оттеняющего металла вращается вокруг оси, перпендикулярной плоскости скола. Это примерно вдвое повышает разрешающую способность формируемой реплики и надежно визуализирует форму мельчайших деталей поверхности скола [520].

Очистка реплик. После оттенения образец размораживается и извлекается из вакуумной камеры. Реплика очищается путем растворения материала образца в подходящем растворителе, для этого используют различные окислители (чаще всего 5%-ный гипохлорит натрия, кислоты, например H2SO4 и хромовую кислоту, щелочи и некоторые другие вещества). Есть специальные коммерческие реактивы для этих целей, например "Хлорокс". При их отсутствии применимы хлорсодержащие бытовые отбеливатели. Главное в этой процедуре - хорошее растворение тканей и максимальная сохранность реплики [6, 42].

Эффективность растворителей для различных тканевых компонентов неодинакова, поэтому лучшие результаты дает последовательное отмывание реплики в ряде различных растворителей. Для рутинных исследований рекомендуется следующая схема: 40-50%-ная хромовая кислота (20-24 ч), дистиллированная вода (10-60 мин), 5-10%-ный раствор едкого натра (10-60 мин) и отмывание в нескольких сменах воды [б].

Если тканевый образец содержит много жировой клетчатки, то на первом этапе отмывания удобно использовать смесь спирта и эфира. Рекомендуется также пользоваться смесью хлороформа и метанола (2:1) или диметилформальдегидом [6, 177, 376).

Более сложная и многоступенчатая процедура предложена в обзоре Северса и Ребенека [444]. Образец с держателем погружают в тот раствор, из которого объекты были взяты для замораживания. Ткань и реплика обычно отделяются от держателя и плавают на поверхности раствора. С помощью платиновой петли объект проводится с 2-минутными интервалами через 30, 20, 10 и 5%-ный растворы глицерина и отмывается (плавает) в дистиллированной воде. После трех смен дистиллированной воды объект переносится в 2%-ный раствор гипо-хлорита натрия (или в 20%-ный отбеливатель) на 30 мин. Раствор должен быть разбавлен, чтобы образующиеся пузыри газа не разрушали реплики. Далее реплики очищают в трех сменах неразбавленного отбеливателя или гипохлорита (по 20 мин) и проводят через несколько уменьшающихся концентраций раствора вплоть до дистиллированной воды. После нескольких смен дистиллированной воды реплики обрабатывают хромовой кислотой при увеличивающихся концентрациях (10, 20 и 30% по 10 мин) и тремя порциями концентрированной хромовой кислоты (по 20 мин). Далее реплики отмывают в 6-10 сменах дистиллированной воды (по 1-5 мин) для удаления остатков хромовой кислоты.

Чистые реплики вылавливают на опорные сетки. Существуют разные способы укрепления реплик на поверхности сеток, например путем обработки сеток раствором клея с липкой ленты [177].

Качество реплики зависит не только от степени ее чистоты. В гораздо большей мере оно определяется свойствами материала реплики, а также способами и условиями его нанесения на реплицируемую поверхность и толщиной оттеняющего слоя. Наиболее распространенной и приемлемой парой материалов для репликации поверхности скола являются платина и углерод. Реплики, формируемые из них, инертны практически ко всем используемым растворителям и обладают достаточной прочностью, мелкой зернистостью, оптимальной контрастностью и довольно высокой разрешающей способностью, составляющей примерно 2-2.5 нм.

Выделяют следующие критерии хороших (качественных) реплик [6, 177, 482]: 1) оттеняющий материал должен быть мелкогранулярным (разрешение лучше 3 нм по точкам) и стабильным под электронным пучком; 2) реплика должна обладать хорошим контрастом (как бы блестеть в электронном микроскопе); 3) комплементарные PF- и EF-поверхности одной и той же мембраны должны хорошо совпадать, а количество углублений соответствовать количеству выступов (это правило неприменимо, если во время скола происходят существенные деформации); 4) клетки и органеллы должны на репликах сохранять тургор, т. е. мембраны должны быть гладкими, без "волн"; 5) каждая мембранная система должна проявлять свою уникальную форму и надмолекулярную организацию; 6) внутримембранные частицы (ВМЧ) должны располагаться, как правило, равномерно или мозаично (диффузное или пятнообразное распределение ВМЧ обычно характеризует, за некоторым исключением, поврежденные мембраны); 7) бугристая поверхность реплики в месте прохождения ножа свидетельствует о загрязнениях парами воды, т. е. текстура срезов должна быть мелкогранулярной.

Качество изображения реплики, полученной при неблагоприятном угле наклона, может быть улучшено путем наклона реплики при рассмотрении ее в электронном микроскопе.

2.2. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЙ

При электронно-микроскопическом изучении полученных реплик приходится решать ряд задач. Во-первых, необходимо идентифицировать встречающиеся структуры и их детали. При этом следует опираться на хорошие знания объекта исследования, полученные при изучении его ультратонких срезов, и на топическое и последовательное сопоставление каждой встречающейся структуры со всеми другими, которые окружают ее на реплике.

Для характеристики поверхностей разлома полезно отметить различия между обшей и тонкой топографией поверхности скола. Первая представляет собой совокупность грубых складок и однородностей с размерами более 1 мкм, а вторая определяется структурами на реплике, имеющими размеры менее 1 мкм.

Ключом к интерпретации деталей, наблюдаемых на реплике скола, является представление о процессе, приводящем к раскалыванию препарируемого образца. В настоящее время установлено, что при встрече с биологическими мембранами скол всегда проходит внутри гидрофобной области (рис. 2), которая в замороженном образце является наименее прочной [177, 482], т. е. результирующая поверхность скола формируется в образце таким образом, что суммарная работа по раскалыванию его гидрофобных и гидрофильных областей оказывается минимальной. В связи с этим локальное направление скола непрерывно меняется, и при изучении реплики приходится решать вопрос о том, каково это направление в каждом конкретном месте. Отправным моментом в таком решении является определение направления напыления платины на поверхность скола. Практически всегда оно совпадает с направлением теней от ВМЧ - небольших (8-15 нм в диаметре) глобул, наблюдаемых на внутренних поверхностях расколовшихся мембран. Далее проводится анализ электронной плотности реплики в направлении напыления. Если плотность растет, то это указывает на увеличение угла, под которым происходило напыление металла на поверхность скола в данном месте, и, следовательно, свидетельствует о локальном подъеме этой поверхности. Если плотность реплики падает, то можно говорить о локальном опускании поверхности скола. В результате такого анализа в каждом конкретном случае появляется возможность решить, какая из двух поверхностей раскола мембраны той или иной структуры воспроизводится репликой в данном месте.

Дополнительную помощь в решении этого вопроса снова могут оказать ВМЧ, плотность которых на каждом из листков расслоившейся мембраны практически всегда различна. Обычно в фиксированных образцах (за рядом исключений) наиболее плотно частицы располагаются на внутреннем листке, представляющем собой поверхность скола той половины мембраны, которая прилежит к цитоплазме клетки. Вторая поверхность скола, которая принадлежит полумембране, обращенной в противоположную сторону, всегда несет на себе значительно меньшее число ВМЧ. В нефиксированных тканях интегральные протеины более прочно связаны с наружной стороной биомембраны, поэтому ВМЧ чаще встречаются на EF-поверхности скола. Альдегиды же сшивают интегральные протеины с цитоплазматическими белками. Соотношение числа ВМЧ на PF- и EF-поверхностях скола называется коэффициентом распределения (Кр), причем Кр меньше единицы, если фиксация не применялась, и превышает ее при использовании фиксаторов [429, 508]. Следует отметить, что это относится не ко всем до сих пор исследованным мембранам.

Деление расколовшейся мембраны на два листка справедливо для всех биологических мембран, принадлежащих как органеллам клетки, так и ее поверхности. Поэтому оно положено в основу современной номенклатуры сколов биомембран, в соответствии с которой поверхности, наблюдаемые на сколах этих мембран, именуются PF (protoplasmic face) и EF (extracellular face).

В более ранних публикациях PF-поверхность обозначалась символами "О", " + " или "А". Вместо EF использовались символы "О", "-" или "В" [90, 92, 177].

В результате вакуумного травления на поверхности скола тканевого образца выявляются еще два типа поверхностей биологических мембран, представляющих собой их "истинные" поверхности (surface). В соответствии с действующей номенклатурой, поверхность любой биологической мембраны, обращенная к цитоплазме, обозначается символами PS (protoplasmic surface), комплементарная ей поверхность (extracellular surface) обозначается ES (рис. 2, Б).

Рис. 2. Схема формирования поверхностей скола в замороженной биологической мембране (А) и прохождения скола по мембранам органелл клетки (Б).

Показаны образующиеся плоскости скола и механизм оттенения ВМЧ и ямок (А), приводится международная номенклатура образующихся поверхностей (Б), см. "Список принятых сокращений".


Наличие теней на реплике создает впечатление трехмерности получаемого при просмотре реплик изображения. Трехмерная информация при изучении реплик ведет к лучшему пониманию пространственной организации внутриклеточных органоидов и созданию реальных представлений о молекулярной архитектонике клеточных мембран, межклеточных контактов и внутриклеточных структур [388].

Большие возможности открываются при использовании для оценки получаемых изображений математических методов анализа [1, 54].

2.3. ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

В последние годы бурно развиваются технические приемы выявления на сколах тех или иных химических веществ. Уже апробирована возможность детектирования с помощью липидных маркеров двух классов липидов - 3?-гидроксистеролов (в том числе холестерина) и анионных фосфолипидов. Для этих целей в первом случае используются либо полиеновый антибиотик филипин, либо сапонины (дигитонин и томатин). В качестве потенциальных маркеров стеролов рассматриваются также бактериальные экзотоксины: стрептолизин и F-гемолизин. Во втором случае применяется 2-полимиксин В (пептидный антибиотик) [73, 442, 467]. Было четко показано, что использование липидных маркеров требует определенных условий фиксации исследуемого объекта, предохраняющих от повреждений не только на уровне мембран (перераспределение ВМЧ, кластеризация образуемых комплексов), но и всей клетки [420].

Установлено, что филипин, связываясь с 3?-гидроксисодержащими стеролами, наиболее распространенным из которых является холестерин, образует с ними молекулярные комплексы в соотношении 1:1. В случае дигитонина и томатина это соотношение также равно 1:1 [467].

Для появления характерных деформаций мембраны необходимо, чтобы она была жидкой, т. е. температура ее должна быть выше точки фазового перехода. Так как индивидуальные бимолекулярные комплексы филипина и сапонинов с холестерином не видны под электронным микроскопом, а мы тем не менее детектируем дефекты мембраны, следовательно, бимолекулярные комплексы могут диффундировать латерально в плоскости мембраны, агрегировать и продуцировать уже видимые деформации. Фиксация альдегидами не ингибирует латерального перемещения комплексов в мембранах, где нет большого количества ВМЧ [444].

При агрегации филипин-стероловых комплексов (ФСК) на мембранах образуются филипин-стероловые деформации (ФСД), которые на сколах имеют вид округлых выступов или комплементарных ямок диаметром около 25 нм и "завитков". На ультратонких срезах появляется характерная картина "завитков". Число ФСД с известными оговорками поддается количественной оценке [371, 372]. Следует четко представлять, что на сколах выявляются не сами ФСК, а лишь вызываемые ими деформации мембран.

Полностью механизмы формирования деформаций пока не расшифрованы. Гипотетическая схема этого процесса для филипина представлена на рис. 3. Связывание с филипином ведет к полной диссоциации стеролов и фосфолипидов, что снимает стабилизирующее влияние стерола на мембрану. Деформация мембраны связана с локализованным возникновением асимметрии поверхностного натяжения с той стороны, где расположены агрегированные ФСК [444]. Выступы и углубления наблюдаются на одной и той же мембране, что свидетельствует о доступности для реактива обоих слоев биомембраны. Чувствительность реакции снижается в присутствии сфингомиелина, но возрастает с увеличением концентрации филипина, однако повышение осмотического давления в среде ингибирует этот процесс [73]. Существуют и другие факторы, ограничивающие применимость филипина для мечения стеролов. Так, замечено, что высокоспециализированные мембраны меньше деформируются под действием филипина. Это связано, как правило, с присутствием большого числа интегральных протеинов (т. е. ВМЧ) или жесткой стабилизацией бислоя примемб-ранными фибриллярными структурами (подробнее см. раздел 4.5).

Рис. 3. Схема реорганизации липидного бислоя при действии филипина с образованием ФСД (по [444], с изменениями).

а - филипин (1) находится в растворе в мицеллярной форме; б - встраивание филипина во внешний слой плазмалеммы; в - связывание филипина со стеролом (2) с образованием ФСК (3) и с изменением ориентации молекулы на 90°; г - начало деформации мембраны в результате увеличения поверхностного натяжения и локального возрастания текучести липидов; д - ФСД мембраны, вызываемые агрегацией первичных комплексов филипина со стеролом (холестерином). Детальная структура ФСД не определена.

Некоторые исследователи считают, что гистохимическая реакция с филипином - метод не количественный, а лишь топографический [467] и в случае отрицательного результата с филипином должны быть использованы сапонины.

Дигитонин и томатин при связывании с мембранными стеролами образуют длинные слегка вогнутые (обычно на EF-поверхности) или выпуклые (на PF) округлые желобки или гребни шириной 40-60 нм, что, как правило, сочетается с перераспределением ВМЧ. Эти складки интенсивно переплетены друг с другом, при продолжительном инкубировании они могут замыкаться и отделяться от мембраны с формированием дискретных внемембранных трубочек. После воздействия сапонинов на репликах преобладают поперечные сколы, а более или менее крупные по площади тангенциальные сколы мембран встречаются редко [444]. Выявляемые дефекты в случае использования сапонинов чрезвычайно вариабельны. Предварительная или одновременная фиксация при их использовании еще более необходима, так как они значительно больше, чем филипин, повреждают мембраны и клетки. Относительно различий в повреждающем эффекте сапонинов в литературе нет однозначного мнения. Некоторые авторы считают, что томатин более щадящий агент, чем дигитонин [180]. Однако наши наблюдения и данные других авторов [444] не подтверждают этой точки зрения.

Механизмы проникновения филипина и сапонинов в клетки, по-видимому, различаются. Сапонины в клетку проникают через поврежденные участки плазматической мембраны (обнаружение сапониновых дефектов на внутриклеточных мембранах сопряжено, как правило, с повреждением плазматической мембраны), а филипин связывается вначале со стеролами плазматической мембраны и лишь затем свободные молекулы филипина диффундируют в клетку (в этом случае повреждений плазматической мембраны не видно).

Гистохимические реакции с филипином и сапонином выполняются перед ЗС. Филипин практически нерастворим в воде, поэтому перед добавлением фиксатора или буфера он должен быть растворен в небольшом объеме диметилсульф-оксида или диметилформамида. Таким образом довольно легко достичь концентрации 50-200 мкг/мл. Чаще всего используется филипин с концентрацией 0.3 моль/л в кокадилатном буфере, концентрация которого 0.1 моль/л. Сапонины обычно применяются в тех же концентрациях. Инкубация производится в темноте при комнатной температуре и при постоянном помешивании. Если обработку филипином проводить при околонулевой температуре, то он связывается со стеролами, но характерных деформаций мембраны не образуется [371]. Из-за возможности аутолитических изменений и повреждающего действия филипина (как и других маркеров липидов) на мембрану необходимо параллельно (или раньше) осуществлять фиксацию альдегидом. Без применения фиксатора образуются внемембранные трубковидные липидные структуры.

Формирование комплексов дигитонин-холестерин не зависит ни от использования глютаральдегида и глицерина, ни от температуры. Следовательно, если задачи исследования диктуют исключение фиксации в схеме препаровки, то это вполне может быть реализовано. Однако количественное исследование в этом случае невозможно. Следует помнить, что как филипин, так и сапонины проникают в ткани только на ограниченную глубину, что при ограниченном инкубационном периоде может давать очень варьирующую по выраженности картину реакции. Поэтому наиболее подходящими объектами при использовании гистохимической реакции на стеролы являются клеточные суспензии или монослойные клеточные образования. Можно применять срезы, сделанные на вибротоме [371, 444].

Более однородные результаты получаются в случае продолжительности инкубации 3-24 ч. При последующем скалывании образцов необходимо получать сколы как можно ближе к поверхности образца. Проникновение филипина в плазмалемму через некоторое время приводит к появлению ФСД и во внутриклеточных мембранах, но лишь после того как филипин свяжется с большинством доступных стеролов плазмалеммы.

Другие перспективные маркеры холестерина - стрептолизин и F-гемолизин - образуют на мембранах выступающие кольца или дугообразные структуры с диаметром 30-50 нм и одновременно приводят к агрегации ВМЧ, что серьезно лимитирует их применимость в качестве цитохимических маркеров [444]. Таким образом, из всех описанных маркеров наиболее удачен и широко распространен филипин. Он менее всех разрушает мембраны, наиболее чувствителен, а образуемые им деформации относительно невелики, дискретны и легко поддаются подсчету [444].

В последние годы большие надежды связываются с пептидным антибиотиком полимиксином В, который селективно связывается с отрицательно заряженными липидами. Полимиксин В даже в низких концентрациях соединяется с мембранами большинства грамотрицательных бактерий. Его использование не имеет принципиальных особенностей в технике препаровки по сравнению с филипином и сапонинами. Живые клетки, преимущественно в суспензии, инкубируют (20-30°С) в забуференном растворе полимиксина перед фиксацией и далее замораживают и скалывают. Концентрация антибиотика варьирует от 1 до 300 мкг/мл, а продолжительность процедуры от 1 до 60 мин. Этот препарат медленно и неравномерно проникает в ткани. Под влиянием изменения поверхности натяжения на PF-поверхности скола возникают возвышения с гладкой поверхностью. Изменения очень полиморфны. Число и размеры деформаций во многом аналогичны таковым для филипина. Некоторые мембраны обнаруживают асимметрию в их распределении [444].

В процессе развития метода ЗСТ постоянно вставал вопрос: нельзя ли специфически пометить в мембранах не только липиды, но и другие молекулы? Вначале для этих целей использовались лектины и антитела, конъюгированные с ферритином. При последующем ЗС-ГТ обнажалась истинная ES-поверх-ность, на которой после оттенения были видны молекулы ферритина. В качестве маркера был использован также вирус инфлюэнцы, который связывался с гли-копротеидами плазмалеммы и формировал характерные вдавления на PF- и возвышения на EF-поверхностях [512]. Однако традиционные молекулярные метки (ферритин, гемоцианин и др.) в этом случае оказались малоприемлемыми, поскольку их очень трудно идентифицировать на репликах (они малоотличимы от ВМЧ). Кроме того, если ферритин не оттенен, то на реплике он практически не виден.

Все более широкое применение коллоидного золота в качестве зонда привело к тому, что у метода ЗСТ появились новые возможности. В качестве маркера коллоидное золото обладает рядом преимуществ: 1) его частицы хорошо связываются с разными макромолекулами, в частности с лектинами и антителами; 2) можно использовать частицы золота разного диаметра, что позволяет в принципе одновременно метить несколько мембранных антигенов или других макромолекул; 3) этот маркер имеет высокую плотность, благодаря чему золотую метку можно наблюдать сквозь угольно-платиновую реплику.

Развитие метода шло по двум направлениям. Первое включало обработку клеток или тканей лигандами, связанными с коллоидным золотом, замораживание, раскалывание, оттенение и последующий (без коррозии тканей) анализ EF-поверхностей реплик в электронном микроскопе [271, 385, 388]. Исследования препаратов с помощью стереопар доказали, что частицы золота находятся под плоскостью реплики, т. е. на наружной стороне мембраны [385]. С помощью этого метода удалось получить доказательства, что ВМЧ представляют собой места локализации интегральных трансмембранных протеинов [385]. Однако данная методика имеет существенные ограничения, поскольку спектр ее применения лимитирован клеточными взвесями или апикальными плазмалеммами клеток, выстилающих полые органы.

Второе направление предполагало замораживание, раскалывание, оттаивание, инкубацию с лигандом, оттенение, очистку реплик и их анализ [385]. Недостатком данной методики является то обстоятельство, что после оттаивания возникает прямой контакт гидрофобной зоны монослоя липидов с жидкостью. Это немедленно приводит к его сворачиванию в бислой, поэтому ВМЧ на репликах не выявляются. И хотя предпринят ряд попыток решить эту проблему [385, 388], до сих пор одномоментное выявление ВМЧ и метки на всех сколах биомембран, за исключением EF-листка апикальной мембраны эпителиев, встречает огромные трудности. В какой-то степени эти трудности были разрешены путем сочетания следующих процедур: замораживание, скалывание, оттенение платиной, оттаивание и инкубация с меченым лигандом. Далее следуют замораживание-высушивание (или высушивание путем перехода через критическую точку в СО2) и затем напыление угольной пленки. После коррозии тканей и очистки реплики просматривают в электронном микроскопе. Данный метод позволяет лиганду связываться с ВМЧ в области теней, образуемых платиной. С его использованием удалось продемонстрировать прямую корреляцию ацетилхолиновых рецепторов с ВМЧ [401]. В некоторых работах [444] предложено также после напыления заключать образцы в эпоксидные смолы и делать ультрасрезы, параллельные сколотой поверхности, либо получать срезы на криоультратоме. В этом случае возможно мечение лигандами как перед замораживанием, так и после оттенения. На препаратах картины, характерные для реплик, соседствуют с изображениями, свойственными ультратонким срезам. Однако, как и другим модификациям, этой технике присущи свои артефакты, поскольку оттаивание и инкубирование с лигандами гидрофобного слоя мембран ведет к его деформации. Метод раскалываниячжазался полезен для доставки лигандов к внутриклеточным мембранам с последующим применением рутинной техники ультратонких срезов [385, 515].

Новым перспективным направлением в развитии метода ЗСТ стало его сочетание с гистоавторадиографией. Эта комбинация позволила соединить преимущества обоих методов и после длительного усовершенствования в настоящее время стала доступной для широкого применения. Предложены даже специальные установки для ее реализации [431]. Обычно после введения изотопа через некоторое время следуют фиксация и инфильтрация криопротекторами (эти этапы можно исключить), замораживание, скалывание и напыление платины и угля.

Предложены различные приемы нанесения фотоэмульсии на напыленную поверхность (в вакууме и вне вакуума) [168, 258, 431]. Наиболее эффективно проблема покрытия сколов эмульсией при низкой температуре решается следующим образом. Поскольку при обычном способе формирования монослоя фотоэмульсии она высыхает, а высохший монослой не адгезируется к поверхности образцов, то к эмульсии добавляют немного глицерина, он медленно испаряется в вакууме и не дает высохнуть монослою эмульсии [431], который создается на конце полой трубки. Непосредственно перед покрытием эмульсией на скол накапывается небольшое количество (около 1 мкл) 4-пропанола или бутанола.

Трубка опускается на образец, и монослой эмульсии с каплей пропанола покрывает сколотую поверхность, имеющую температуру -130°С. Через несколько минут жидкость испаряется и монослой плотно прилегает к сколу. Далее образцы помещают в сосуд Дьюара на плавающей подставке и экспонируются при -100°С в течение 6-12 нед. Затем следуют оттаивание, проявление автографа и его закрепление. Гранулы серебра на реплике можно стабилизировать, напыляя добавочный слой угля [431]. Однако эта процедура требуется лишь в том случае, если в последующем применяются жесткие окислители, такие как хромпик. Между тем нанесение второго слоя угля предполагает повторное вакуумирование, что может существенно повреждать реплики.

Подмечено, что сколы, имеющие глубокий рельеф, обычно покрываются эмульсией лишь частично. Поэтому скалывание лучше осуществлять с помощью микротома либо в вакууме, либо под слоем жидкого азота [431].

Таким образом, приведенные в настоящей главе сведения показывают стремительный прогресс метода ЗСТ во всех направлениях. Расширение методических возможностей делает его не только равноправным партнером таких традиционных методов электронно-микроскопического исследования, как просвечивающая электронная микроскопия ультратонких срезов и сканирующая электронная микроскопия, но и в ряде случаев монополистом для решения многих исследовательских задач.


## Глава 3

. АРТЕФАКТЫ

В соответствии с последовательностью этапов препаровки образцов для ЗСТ, вероятные артефакты можно разделить на следующие большие группы: 1) связанные с подготовкой образцов к замораживанию, 2) обусловленные процессом замораживания, 3) возникающие во время раскалывания и травления, 4) возникающие в результате процессов оттенения, 5) обусловленные способами очистки реплик, 6) формирующиеся во время просмотра препаратов в электронном микроскопе [86, 483].

Артефакты первой группы включают изменения, характерные для действия таких препаративных процедур, как центрифугирование (перемещение органелл, особенно в эукариотических клетках), разделение и агрегация ВМЧ за счет сил, возникающих в местах физического соприкосновения структур, формирование везикулярных и тубулярных мембранных структур (например, мезосом в прокариотах), перемена газового состава в окружении образца (например, анок-сия), изменения концентрации растворов, связанные с испарением растворителя (воды) во время размельчения и монтажа образцов (осмотический эффект, сдвиги рН или ионной силы раствора могут вызывать сжатие клеток и органелл и агрегацию ВМЧ). Артефактогенными являются изменения температуры образца перед замораживанием (может возникать фазовое разделение мембранных липидов, т. е. переход из жидкокристаллической фазы в гелевое состояние) и процессы при его отмывании [86].

Значительные структурные повреждения возникают при инфильтрации криопротекторами нефиксированных образцов. Описаны следующие изменения: 1) необратимый плазмолиз клеточных мембран, 2) изменение формы органелл (митохондрий, цитоплазматической сети и других, например набухание митохондрий, везикуляция цитоплазматической сети, образование микровезикул около плазмалеммы), 3) агрегация ВМЧ и другие изменения мембран, 4) маскирование тонких структурных деталей вследствие фазового разделения (это видно после травления на большинстве подвергнутых криопротекции образцов), 5) изменения в частоте плоскостей, потенциально готовых к раскалыванию [86, 483] (например, диметилсульфоксид не только приводит к образованию скопления ВМЧ, но и индуцирует образование крупных мембранных пузырей). В случае применения не проникающих через мембраны криопротекторов (поли-винилпирролидон и др.) наблюдается сжатие клеток из-за осмотической дегидратации [322, 483].

Большая группа артефактов связана с использованием химической фиксации. Сюда можно отнести изменения, обусловленные медленным проникновением альдегидного фиксатора: перераспределение ВМЧ, уменьшение доли мембранно-ориентированных плоскостей скола, нарушение типичного поведения мембран при скалывании, формирование свободных от ВМЧ мембранных пузырей, индуцированное слияние мембран. При использовании в качестве фиксатора раствора осмиевой кислоты резко снижается выявляемость плоскостей скола, проходящих вдоль мембраны, меняются обычные пути раскалывания мембран, а в некоторых случаях формируются артефактные мембранные структуры (например, мезосомы бактерий). Наконец, даже обработка криопротекторами образцов после химической фиксации может в ряде случаев вести к изменениям распределении ВМЧ по плоскости скола, маскированию тонких структурных деталей за счет фазовых переходов, индуцированию слияния мембран.

Артефакты, обусловленные процессом замораживания, главным образом связаны с механизмами образования кристаллов льда. Физические основы этого процесса и способы профилактики артефактов подробно изложены ранее. Поскольку разрешающая способность метода реплик составляет приблизительно 1.5-2.0 нм, то кристаллы льда, образующиеся при замораживании биологических объектов, не должны превышать этой величины. Кристаллы льда могут возникать и при нагревании замороженного образца выше температуры - 130°С, которая используется для более быстрого удаления замороженной промежуточной среды. Лишь метод замораживания под высоким давлением вселяет надежду на успешное решение этой проблемы. Однако и он не лишен артефактов. Например, давление в 20 МПа переводит в стадию возбуждения нерв речного рака. Высокое давление оказывает летальное действие на клетки, влияет на молекулярную организацию липидной фазы в мембранах. При повышении давления на 100 МПа температура фазового перехода значительно (до 20°С) увеличивается. При давлении 200 МПа имеет место обратимая денатурация белков [38, 343, 344].

И все же, пока вышеуказанные методы замораживания не стали рутинными, использование проникающих или не проникающих через мембраны криопротекторов остается насущно необходимым. В то же время следует ясно себе представлять, что степень приемлемости получаемых артефактов в огромной степени зависит от тех специфических задач, которые будут решаться в данном исследовании. С другой стороны, поскольку техника сверхбыстрого замораживания внедряется все шире, уровень требований (притязательности) к получаемым результатам повышается.

Ряд артефактов связан и с новыми методическими подходами, в частности с различными способами сверхбыстрого замораживания. Среди них можно отметить разрывы кусочков во время контакта с металлическими поверхностями непосредственно перед охлаждением. Могут возникать повреждения во время манипуляций с пипеткой и последующего напыления материала на сверхохлажденную поверхность.

Процесс раскалывания кусочка сопровождается эффектами сжатия и растяжения. При использовании охлажденного ножа микротома впереди ножа образуются хлопья (кусочки тканей). Происходит сдвиг отдельных структур. Поэтому, например, прерывистость плотных контактов (ПК) может быть обусловлена потерей соединительных структур в процессе скалывания. Возможны перемещения отдельных кусочков тканей по поверхности скола. Откалываемые фрагменты замороженных кусочков (стружки) обычно находятся в недостаточном термическом контакте с микротомным ножом и служат постоянным источником образования паров воды, конденсирующихся на сколотой поверхности. В ряде случаев на репликах, изготовленных с использованием охлажденного ножа, имеются участки, содержащие зоны расплавления, вызванные освобождением энергии, образующейся при трении ножа о поверхность образца.

Очень ценным инструментом анализа артефактов является метод комплементарных реплик. Оказалось, что в ряде случаев при раскалывании пропадает комплементарность многих тонких структур. Данный феномен в большинстве случаев объясняется пластической деформацией и перемещением некоторых компонентов образца [483]. С другой стороны, оттеняющий слой платины конечной толщины может маскировать углубления на поверхности скола и увеличивать размеры выступающих структур. Кроме того, углубления могут заполняться конденсирующимися парами воды или других веществ. Так, известно, что даже при температуре объекта, близкой к абсолютному нулю, биологический материал в области скола может подвергаться существенной пластической деформации [481-483]. Во время скалывания гранулы обычно деформируются асимметрично. Одна половина сферы оказывается почти полностью погруженной в матрикс (лед, цитоплазму), а другая часть испытывает большие деформации.

Рис. 4. Схема изменений мембраны при скалывании (по [108], с изменениями).

Предполагается, что при препаровке происходит коллапс липидного монослоя с нарушением комплементарности. Прерывистой линией показано прохождение скола; звездочкой обозначены ямки, сохраняющиеся после коллапса липидов. P1 и Р2 ВМЧ на PF, а E1 н Е2 - на EF мембраны. Пояснения см. в тексте.


Сейчас стало ясно, что сам монослой липидов после раскалывания в течение неизбежного периода травления подвергается сжатию (особенно при температуре - 100°С и выше), что приводит к исчезновению неглубоких Ямок [483] (рис. 4). Значительно изменяют параметры скола биомембран и вещества, образующие поперечные связи в интегральных и примембранных белках, например глютаральдегид. Они сшивают мембрапно-интегрированные полимеры с подлежащими фибриллярными структурами, например с элементами примембранного цитоскелета. Такое взаимодействие меняет соотношение ВМЧ на PF- и EF-поверхностях, а иногда может "вытаскивать" цитоплазматические структуры на EF-поверхность скола. В то же время после химической фиксации в ряде случаев улучшается комплементарность получаемых реплик (86].

Отмечено, что деформации мембранных структур значительно уменьшаются после инфильтрации образцов в глицерине [154]. Это обусловлено тем, что выделяемое при сколе тепло несколько размягчает окружающий матрикс и пластические деформации структур уменьшаются. Повреждения можно также уменьшить, если снизить температуру, при которой производится скалывание (например, до -269°С), для этого уже созданы коммерческие приборы [270].

Однако существенных различий в общей топографии поверхности разлома биологических образцов ни при понижении температуры до температуры плавления жидкого гелия, ни при повышении вакуума, ни при раскалывании под слоем жидкого газа не обнаружено [482, 483]. При раскалывании образца могут возникать вне плоскостей мембран так называемые ступеньки скола, легко идентифицируемые на репликах.

Особенно часто артефакты метода ЗСТ возникают в тот промежуток времени, который начинается от момента обнажения скола и до окончания напыления. Главной опасностью являются конденсационные артефакты. Их образование зависит от условий вакуума вокруг образца, температуры образца, позиции скола по отношению к более нагретым структурам, наличия и положения более холодных ловушек.

Конденсация паров имеет определенные закономерности. Так, вначале конденсация идет на выступающих частях, например на ВМЧ, и лишь затем на гладкой поверхности, что усиливает рельефность. Если используется охлажденный микротомный нож в вакууме, то конденсация более всего выражена на вогнутых мембранных сколах, которые длительно (в течение нескольких циклов резания) оказываются обнаженными. Во время последовательных движений микротомного ножа покрытые конденсатом неглубокие сколы удаляются, а более глубокие остаются и выраженность артефактов даже увеличивается. Поэтому на одном образце могут присутствовать участки с конденсатом и без него. Возможно формирование резко выступающих над поверхностью образца шипов. Сублимация паров воды в основном направлена вперед, перпендикулярно ножу, поэтому рекомендуют для предупреждения контаминации располагать нож с обломками образца впереди препарата [38].

Большое число ямок, комплементарных ВМЧ, обычно говорит о высоком качестве реплик. Однако их присутствие все же однозначно не исключает возможности артефактного появления частиц на поверхности реплик и особенно изменения их истинных размеров. Точно так же отсутствие ямок еще не свидетельствует о наличии контаминации парами воды, так как они могут исчезать при коллапсе монослоя липидов, избыточном напылении, механических деформациях и т. д. В то же время углубления на поверхности скола в ряде случаев являются местами, где преимущественно может осуществляться процесс конденсации льда [109].

Существует несколько способов предупреждения контаминации поверхности скола. Можно использовать сверхвысоковакуумные системы, устройства поглощения, или ловушки, конденсирующие пары воды и находящиеся в непосредственной близости от объекта [109]. Разработки велись в двух направлениях: 1) получение сверхвысокого вакуума, содержащего минимум конденсирующихся газов во всей камере, 2) создание тех же условий только в районе нахождения образца. Первое направление реализовано лишь в специальных коммерческих аппаратах [208], второе осуществлено в двух вариантах: 1) в виде особых подвижных охлаждаемых ловушек [482], которые позволяют достигнуть парциального давления воды над образцом 1.33•10-11 Па; 2) хорошо предупреждает от контаминации техника холодного блока (см. выше). Наиболее убедительным тестом низкого потенциального уровня контаминации и качества вакуума данной установки может служить экспонирование расколотых кусочков в течение длительного периода времени с последующим приготовлением реплик.

В большинстве современных устройств используются охлаждаемые жидким азотом ловушки вокруг образца, которые значительно снижают парциальное давление паров воды в области скалывания.

В случае применения очень сложного сверхвакуумного оборудования [208, 209] степень загрязнения реплик значительно снижена. Тем не менее иногда наблюдается специфическое декорирование паракристаллических областей EF-поверхности, по-видимому, за счет конденсации остаточных паров воды. Образующиеся кристаллические частицы, видимые на поверхности скола, могут быть приняты за ВМЧ.

Не подтвердились опасения насчет появления на сколотой поверхности, покрытой жидким азотом или гелием, слоя адсорбированного материала, который будто бы не может быть удален с помощью травления даже при сверхвысоком вакууме [483]. Более того, скалывание под защитой жидкого азота имеет определенные преимущества из-за снижения загрязнений.

Процесс травления сам по себе способен вызывать возникновение артефактов. Для гидратированных протеиновых молекул можно ожидать их сжатие. Отметим, что поверхностная сублимация не исключает коллапса вытянутых фибриллярных структур, сформированных в результате механических воздействий во время раскалывания. Эти артефактные структуры, примороженные к поверхности скола, могут после сублимации воды за счет естественной эластичности приобретать исходное реальное состояние.

Наконец, предполагается, что во время длительного травления частицы, освобождаемые из-подо льда, могут перераспределяться в случайные и даже кристаллоидные агрегаты. Более того, если уровень травления слишком высок, эти макромолекулярные ансамбли и даже клетки могут сбрасываться с поверхности скола из-за бомбардировки их молекулами воды, сублимирующимися с поверхности (феномен "ветра водных паров"). При глубоком травлении образцов, обработанных криопротекторами, вследствие сублимации воды и задержки сублимации глицерина возможно образование теней глицериновых капель и тяжей [86].

Контрастирование обнажающихся при сколе структур основано на допущении, что при контакте с препаратом молекулы платины адсорбируются в месте их попадания. Практически они мигрируют по поверхности образца вследствие рассеивания освобождающейся кинетической энергии, до тех пор пока энергия не будет окончательно погашена на специальных сорбирующих местах поверхности скола, обладающих необходимыми для этого определенными физико-химическими свойствами, или на ранее конденсированных атомах или платиновых микрокристаллах. Этот механизм образования металлической пленки, известный как преимущественная нуклеация или декорирование, представляет основную проблему при интерпретации реальных ультраструктурных деталей на плоскости скола [483].

Образование дискретных кристаллов платины может вести к существенным изменениям размеров и формы исследуемых структур. Если оттеняются детали несферической формы, то степень соответствия между геометрией истинной структуры и ее изображением на экране микроскопа будет сильно зависеть от ориентации структуры по отношению к источнику напыления и от угла оттенения. Эти соображения оказываются менее важными (хотя остаются существенными), когда рассматриваются результаты напыления при вращении. Поэтому очень важно уметь распознавать картины, обусловленные оттенением и декорированием. Это особенно важно, если реплики получаются с помощью кругового напыления при малых углах оттенения.

Ухудшение вакуума во время оттенения и появление остаточного газа, способного конденсироваться на обнаженной поверхности, также может ухудшать изучаемые ультраструктуры. Следует отметить, что ухудшение вакуума во время репликации может быть существенно снижено, если непосредственно перед напылением прогреть испарительное устройство до температуры, близкой к рабочей.

Объекты могут повреждаться тепловой радиацией и электронной или ионной бомбардировкой, обусловленной процедурой нагревания распылителя. Указанные повреждения следует свести к минимуму путем использования подвижных экранов с отверстиями. Поглощение тепла образцом обычно способствует описанным выше эластическим деформациям структур после сублимации воды. При очень больших углах наклона плоскости скола псготношению к распылителю образуются слишком прозрачные и неконтрастные реплики. Напротив, увеличение времени напыления вызывает уменьшение прозрачности реплик, делая их малопригодными для просмотра. При напылении угольной пленки может происходить разрушение угольных стержней и попадание угольных частиц на реплику [86]. Если уголь распылять через некоторое время после оттенения платиной, то не исключена возможность возникновения конденсатов льда между слоем угля и платины. Поэтому второе напыление должно осуществляться немедленно после первого.

Артефакты иногда возникают и при последующих препаровочных процедурах. Во время коррозии ткани и последующего отмывания реплики возможно отделение участков реплики (как правило, структур, со всех сторон окруженных тенью и не связанных вследствие этого с оставшейся частью реплики) с образованием своеобразных дыр и перемещением отделившихся участков в другую часть реплики [86].

Если рельеф поверхности скола очень высокий, то не исключено появление длинных переплетающихся теней, вдоль которых под действием сил поверхностного натяжения реплики могут разрываться на мелкие кусочки. Для предупреждения этих артефактов предложены различные методы. Одним из них является способ коррозии, за счет подачи раствора окислителя с помощью капиллярных сил (образец находится на поверхности лоскута искусственного шелка, края которого погружены в растворитель [41]). Если растворение подлежащих тканей проведено не очень тщательно, то они просвечивают через реплику, затрудняя анализ этих участков сколов. Недостаточно чистые реактивы и промывающие жидкости также очень часто загрязняют реплики. Это проявляется в виде образования так называемых фигур высыхания или филамен-тозных структур [332]. Профилактика этих артефактов предполагает более тщательную обработку образцов в окислителях и дистиллированной воде. Наконец, при неаккуратном взятии реплики на электронно-микроскопическую сеточку возможно складывание реплик.

Приведенные здесь данные показывают, что метод ЗСТ не только не оправдал надежд его создателей, стремившихся разработать безартефактный метод, но и оказался едва ли не самым опасным в смысле артефактогенности методом морфологического анализа.


## Глава 4

. КЛЕТОЧНЫЕ МЕМБРАНЫ. ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ

Для современного этапа в изучении структурно-химической организации биологических мембран характерны следующие тенденции: 1) повышенный интерес к изучению нелипидной части мембран и сил взаимодействия между белками и липидами; 2) переход от представлений об универсальности организации клеточных мембран к конкретному изучению их специфики и отдельных локусов; 3) более тщательный анализ белкового и липидного состава (включая минорные компоненты) различных клеточных мембран и специфики их организации в срединной, гидрофобной области мембраны. Несмотря на то что наличие билипидного слоя (прерывного или непрерывного), занимающего всю мембранную структуру или ее часть, всеми принимается, имеется ряд данных, указывающих на его существенные отличия от организации липидов в искусственных билипидных пленках и липосомах (структурная и химическая асимметрия, наличие участков, в которых липиды организованы в монослои и т. д.).

Для решения этих вопросов привлекаются различные физические методы исследования (методы оптической активности и рентгеноструктурный, инфракрасной спектроскопии, ЭПР, ЯМР и др.). Они дают, как правило, усредненные (интегральные) сведения о всех компонентах исследуемых объектов, и в случае сложных гетерогенных систем (целостные клетки, мембранные препараты) интерпретация результатов в терминах структуры клеточных мембран необычайно сложна. Выделение же относительно однородных компонентов мембран сопряжено с их деструкцией и цитоплазматическими "загрязнениями". В связи с этим знание надмолекулярной картины биологических мембран in situ совершенно необходимо для адекватной интерпретации данных, полученных вышеперечисленными методами.

Только электронно-микроскопические исследования в состоянии визуализировать мембранную структуру клетки. Хотя эти методы также таят в себе много подводных камней, их удается частично обойти, используя большой набор приемов подготовки объектов для этих исследований. Существенный вклад в этом смысле внесли физические методы препарирования объектов: замораживание с последующим замещением воды менее полярными растворителями при низких температурах (freeze-substitution), замораживание с последующим высушиванием в высоком вакууме при низкой температуре (freeze-drying) и ЗСТ с последующим получением реплик с вскрытых поверхностей (freeze-fracture, freeze-cleaving, freeze-etching). Применение этих методов дало возможность выявить структуру биологических мембран в более нативном состоянии и исключить ряд артефактов, связанных с использованием химической фиксации. Следует сказать, что последний из указанных методов оказался наиболее плодотворным при анализе надмолекулярной организации гидрофобных областей биологических мембран. Это по сути дела единственный электронно-микроскопический метод, в котором объект не взаимодействует с органическими растворителями, в этом смысле он наиболее близок к физическим методам исследования твердого тела.

Изучению ультраструктурной организации клеточных мембран методом ЗСТ предшествовал ряд основополагающих исследований другими методами, результаты которых позволили относительно корректно и однозначно интерпретировать электронно-микроскопические изображения реплик различных областей клеточных мембран. В связи с этим необходимо кратко изложить эволюцию представлений и соответствующих им моделей структурной организации клеточных мембран до использования метода ЗС.

4.1. МОДЕЛЬ ДАНИЕЛЛИ-ДАВСОНА-РОБЕРТСОНА

Основные идеи и экспериментальные факты, приведшие к созданию этой модели, были высказаны и получены задолго до визуализации клеточных мембран в электронном микроскопе и связаны с работами Овертона, Лангмюра, Гортера и Грендела, Даниелли, Гарвея, Давсона, Шмитта (лит. см. [4]). Робертсон в 1957 г. [418], используя метод ультратонких срезов, почти одновременно с Шёстрандом [474] получил электронно-микроскопическое изображение плазматической мембраны в виде четкой линейной трехслойной структуры, хорошо трактуемой в терминах высказанных ранее идей [141]. На основании электронно-микроскопического анализа структурной организации плазматических и внутриклеточных мембран самых различных клеток и тканей, учитывая существующие результаты физиологических, биохимических, рентгено-структурных и других подходов для исследования этих структур, Робертсон выдвинул гипотезу элементарной мембраны (unit membrane), согласно которой все клеточные мембраны построены по единому принципу.

Основная характеристика рассматриваемой модели - непрерывность липидного компонента. Первоначально предполагалось, что липидные молекулы вытянуты и ригидны. Однако после рентгеноструктурных исследований [308] стало ясно, что углеводородные цепи жирных кислот находятся в "жидком состоянии", так как бимолекулярный слой мембранных липидов, находящийся в водном окружении в условиях, аналогичных тем, которые существуют в реальной клетке, значительно меньше, чем длина двух вытянутых липидных молекул. Дополнительные данные о жидком состоянии углеводородных цепей липидных молекул мембран и мембранных комплексов были получены с помощью инфракрасной спектроскопии, ЯМР и дифференциальной калориметрии. Эти данные указывают на то, что как в случае биологических мембран, так и в случае выделенных мембранных липидов температура плавления ниже обычных физиологических температур среды, окружающей клетки. Таким образом, схема с двойным слоем вытянутых углеводородных цепей липидных молекул не соответствует имеющимся экспериментальным данным и не может быть принята. Представление о конформации белков и их расположении в мембране, первоначально постулированное в модели Даниелли-Давсона-Робертсона, также подвергалось существенным изменениям. Изображение этой модели в виде симметричной структуры было связано с отсутствием данныхо различном составе белков и липидов в обеих половинах мембраны.

Следует указать, что ряд электронно-микроскопических и рентгеноструктурных данных, которые использовались ранее для доказательства правомочности этой гипотезы, не могут однозначно интерпретироваться в терминах рассматриваемой модели [279]. Серьезным аргументом против этой модели являются также данные о том, что электронно-микроскопическая картина некоторых мембран, в которых после экстракции отсутствуют липиды, представляет собой трехслойный мембранный комплекс [170, 247, 496]. Факт существования мембранных структур, в которых отсутствуют липиды, важен для понимания структурно-химической организации биологических мембран. Ранее считалось, что только липиды и липопротеины способны создавать мембраны в условиях организма. В этой связи представляют интерес работы Янагода и Нада [250], которым удалось выделить из плазматических мембран амебы белковые субъединицы. Последние могли ассоциироваться в мембранные структуры, которые контролировались разными электронно-микроскопическими методами. Авторы пришли к заключению; .что в процессе самосборки мембран из липопротеиновых субъединиц их протеиновая часть играет важнейшую роль.

Рис. 5. Различные модели строения биологических мембран.

А - Даниелли-Давсона [141]; Б - Робертсона [4181; В - Ленарда-Зингера [300]; Г - Вандеркоя- Грина [526]; Д - Бензона [76].

Модель Даниелли-Давсона-Робертсона за время ее существования претерпела ряд значительных изменений. В одной из последних модификаций этой модели [495] по сути дела только главное ее положение осталось незыблемым, а именно то, что гидрофильные группы липидов обращены наружу, образуя полярные связи с протеинами мембраны, но даже в этой интерпретации модель не учитывала наличия гидрофобных неспецифических взаимодействий между белком и липидом (рис. 5).

4.2. ЛИПИД-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В МЕМБРАНЕ

Основная информация о силах, стабилизирующих липид-белковые взаимодействия, получена на выделенных мембранах, отдельных липопротеиновых и белковых субъединицах, а также на искусственных модельных системах. Прямые сведения о существовании ионных взаимодействий между белками и липидами получены лишь на искусственных комплексах фосфолипидов, имеющих суммарный отрицательный заряд, с некоторыми основными протеинами (протеиназой, гистоном, цитохромом С, гемоглобином, РНКазой, лизоцимом и др.) ниже их изоэлектрической точки. Такие комплексы диссоциируют при высоких ионных силах. В отличие от такого рода комплексов липопротеины большинства исследованных мембран не диссоциируют сколько-нибудь заметно при различных значениях ионной силы и рН среды. Данные о существенной роли гидрофобных липид-белковых взаимодействий были получены еще в 60-х годах на плазматических и внутриклеточных мембранах ряда клеток. Так, в плазматических мембранах галобактерий все липиды имеют отрицательный заряд. При титровании положительных белковых групп до смены знака на обратный не происходит заметного освобождения липидов [99]. Грин и Фляйшер [205] показали, что комплексы структурного белка с митохондриальными фосфолипидами не диссоциируют в солевых растворах. Связь "структурного" белка с алкилированными фосфатами зависит, по мнению авторов, только от длины и природы их углеводородных цепей. Ионные группы алкилированного фосфата остаются свободными и образуют тройной комплекс с основным белком - цитохромом С.

Оказалось, что добавление детергентов и органических растворителей имеет существенное значение для экстракции белков из клеточных мембран. Более прямые данные, указывающие на существование неполярных взаимодействий липидов и белков, получены при изучении выделенных мембранных фракций методами ядерного магнитного резонанса и оптической активности. Данные, полученные методом дисперсии оптического вращения, кругового дихроизма и инфракрасной спектроскопии клеточных мембран, позволяют судить о преимущественных конформациях присутствующих в них белков. Рассматриваемая в предыдущем разделе модель структурной организации клеточных мембран предполагала ?-складчатую конформацию, которая предпочтительней для осуществления полярных взаимодействий между белками и липидами. В первых работах по анализу оптической активности мембранных фракций было установлено, что большинство мембранных белков находится в ?-спиральной и беспорядочной (в виде статистического клубка) конформациях [300, 538]. В этих работах белков с ?-складчатой конформацией не было обнаружено. Однако более тщательный анализ спектров оптического вращения и кругового дихроизма показал, что светорассеяние и мутность мембранной фракции могут маскировать ?-складчатую конформацию белков изученных мембран [471]. Наличие ?-складчатой структуры белков было обнаружено также на внутренних и внешних мембранах митохондрий и при помощи других методов.

Прямые сведения о расположении и количестве ?-спиральных участков в мембранных белках были получены при анализе мембранных фракций методами рентгеноструктурного анализа [84, 218]. При этом было показано, что большая часть мембранных протеинов находится в ?-спиральной конформации, причем ?-спиральные участки направлены перпендикулярно мембране. Данные цитируемых работ дают основание считать, что основной вклад в стабилизацию мембранной структуры вносят гидрофобные взаимодействия как между липидами и белками, так и между ?-спиральными участками протеинов. Однако вследствие наличия в мембранных белках участков с ?-складчатой конформацией, учитывая данные по экстракции некоторых белков при высоких рН, нельзя исключить определенную роль полярных взаимодействий в стабилизации мембранной структуры. Таким образом, пространственные отношения протеинов и липидов, характерные для рассмотренной выше модели клеточных мембран, в которой постулировано, что протеины находятся в ?-складчатой конформации и располагаются на полярной поверхности липидного бислоя, не удовлетворяют имеющимся в литературе данным.

Анализ гидрофильных" и гидрофобных взаимодействий указывает на то, что в классической модели Даниелли-Давсона-Робертсона эти взаимодействия не могут максимально реализоваться. В этом смысле трехслойная (непрерывная) модель термодинамически нестабильна. В ней не только неполярные аминокислотные остатки мембранных протеинов должны быть обращены к воде, но также ионные и полярные участки липидов отделены слоем протеинов, предохраняющих их от контакта с водой [472].

4.3. СУБЪЕДИНИЧНЫЕ МОДЕЛИ И ГЛОБУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

Наличие большого количества экспериментальных данных, не укладывающихся в классическую модель Даниелли-Давсона-Робертсона, породило значительное число моделей, в той или иной степени удовлетворяющих накопившимся к этому времени фактам. Предложенные разными исследователями, они имели много общего. Эти модели учитывали ряд твердо установленных фактов: важную роль гидрофобных взаимодействий белок-липид, жидкост-ность углеводородных цепей липидных молекул, электронно-микроскопические данные, указывающие на глобулярный характер выявляемых мембран клеток, наличие функциональных субъединиц, данные о самосборке некоторых мембран и др. Рассмотрим лишь некоторые из них.

Несмотря на то что модель Ленарда-Зингера [300] основана лишь на данных по оптической активности мембранных фракций эритроцитов и бактериальных клеток и не учитывает ряд сведений, полученных другими методами (в частности, в ней игнорируется наличие полярных липид-белковых взаимодействий), она явилась одной из первых моделей, учитывающих ключевую роль гидрофобных взаимодействий в стабилизации мембранной структуры. Эта модель основана на следующих представлениях: 1) полярные головки фосфолипидов вместе со всеми ионными боковыми цепями "структурного" белка находятся на поверхности мембран, контактируя с водой; 2) неполярные цепи вместе с углеводородными цепями фосфолипидов и нейтральными липидами располагаются внутри мембраны, где они стабилизируются гидрофобными взаимодействиями; 3) "структурные" протеины характеризуются определенной последовательностью аминокислот, которые специально приспособлены к липидным компонентам мембраны и водному окружению. Все конформации "структурного" протеина детерминированы этими взаимодействиями (рис. 5).

В модели Бензона [76] белковые глобулы пронизаны липидами. Такая система может в принципе рассматриваться как липопротеиновая субъединица. Углеводородные цепи липидов, полярные головки которых расположены на поверхности мембран, глубоко пронизывают их белковый состав, взаимодействуя с ним гидрофобными связями. Очевидно, что при образовании такой субъединицы вода играет важнейшую роль (рис. 5).

Из предложенных субъединичных моделей схема Вандеркоя и Грина [526] лучше отражала существовавшие представления о структурной организации клеточных мембран. Как и описанные выше модели, она также учитывала важную роль гидрофобных взаимодействий белок-липид и белок-белок. Однако в отличие от них в этой модели была предпринята попытка более детально локализовать отдельные химические компоненты. Основная идея при создании модели была взята авторами из данных по кристаллографическому анализу ряда белков (миоглобина, лизоцима, феррицитохрома С и др.). Рентгеноструктурные исследования этих белков показали, что в белковом кристалле имеется ограниченное число контактов между протеиновыми молекулами. Пространства между контактами заполнены растворителем (водой). Так как боковые аминокислотные остатки, ограничивающие эти полости, преимущественно полярны, присутствие воды энергетически выгодно. Содержание воды в изученных белковых кристаллах достигает 50% от их полной массы.

При создании модели Вандеркой и Грин исходили из предположения, что основной принцип стабилизации белкового кристалла может быть перенесен на структуру мембраны. В этом случае протеины мембран должны иметь относительно большее содержание полярных аминокислотных радикалов на своей поверхности, а полости, образующиеся при ассоциации белковых молекул, должны образовывать непрерывную зону из неполярного растворителя. Имеется ряд доказательств правильности такой аналогии. Так, наличие областей контактов между белковыми молекулами в гидрофобном остове мембраны подтверждается данными по экстракции липидов из мембран митохондрий и миелина [170, 358]. Практически полная экстракция липидов из этих мембран не меняла их электронно-микроскопической картины. Такая ситуация доказывает важную роль межбелковых взаимодействий в поддержании мембранной структуры. Вместе с тем известно, что мембраны, лишенные липидов, менее стабильны, чем интактные. В данном случае, по аналогии с белковым кристаллом, можно говорить о стабилизирующей роли растворителя, т. е. фосфолипидов.

Количественное содержание липидов в мембране (27-64% от объема мембраны) приблизительно соответствует содержанию кристаллизационной воды в изученных белковых кристаллах (35.5 и 55% для лизоцима и миоглобина соответственно). Основное различие между мембранными белками и кристаллами растворенных протеинов, по мнению авторов модели, связано с количеством неполярных аминокислотных остатков на поверхности белковой молекулы. Протеиновые кристаллы, как правило, имеют гидрофобную центральную область, а полярные аминокислоты располагаются на поверхности белковых молекул. Исключение составляет феррицитохром С, в молекуле которого два неполярных псевдоканала простираются от неполярной сердцевины к поверхности. В рассматриваемой модели принимается, что в мембранных белках большинство неполярных аминокислотных остатков находится на поверхности молекул. В пользу такого предположения говорит плохая растворимость мембранных протеинов в водных растворах. Большая часть полярных групп белковой молекулы находится на поверхности мембраны. Не исключается также наличие некоторого количества полярных аминокислот и внутри мембраны. В этом случае в мембране должна присутствовать гидратная вода. К сожалению, данные о количественном содержании воды в мембране широко варьируют, а в ряде случаев противоречивы [167].

Геометрическое расположение белковых и липидных компонентов рассматриваемой модели таково (рис. 5), что в мембране находятся два слоя свободно упакованных глобулярных протеинов. Щели между белковыми глобулами заполнены углеводородными хвостами фосфолипидных молекул, полярные головки которых располагаются на водной поверхности мембраны. В пользу такой локализации говорят данные об энзиматическом расщеплении лецитина мембран фосфолипазой С на фосфорилхолин и диглицерид. Было показано, что в результате такой реакции из мембран эритроцитов и митохондрий освобождался водорастворимый фосфорилхолин, а диглицериды оставались в мембране. Электронно-микроскопический контроль обработанных таким образом мембран не указывал на какие-либо изменения в их структуре. Рассматриваемая модель сравнительно просто объясняла совпадение ряда физических свойств биологических мембран со свойствами искусственных билипидных пленок. Вместе с тем она объясняет также и существенные различия между этими объектами. В частности, проницаемость биологических мембран для воды и других полярных веществ может обеспечиваться полярными группами белков, пронизывающих гидрофобную область мембраны.

Мы рассмотрели лишь несколько из большого числа существующих субъединичных моделей. Идеи и экспериментальные факты, приведшие к созданию этих моделей, были взяты в основном из результатов физико-химического анализа структурной организации биологических и искусственных мембран. Субъединичная организация клеточных мембран подтверждается также электронно-микроскопическими исследованиями. В морфологической литературе такую организацию мембран принято называть глобулярной. Размер глобул, обнаруживаемых при электронно-микроскопическом изучении клеточных мембран методами ультратонких срезов, варьирует в пределах 5-9 нм. Толщина темного слоя, окружающего более электронно-прозрачную сердцевину, приблизительно равна 1-2 нм.

Впервые глобулярное строение мембран митохондрий и эндоплазматического ретикулюма показал Шёстранд [475], фиксируя объекты перманганатом калия. Затем аналогичные картины ультраструктурной организации мембран были получены многими исследователями на различных клеточных мембранах при использовании ряда методических приемов, включая замораживание - высушивание и замораживание - замещение клеток и тканей. Выявленная под электронным микроскопом глобулярная структура мембран, наряду с хорошо выявляемыми картинами ее ламеллярного строения, трактуется некоторыми исследователями как отражение фазовых переходов липидов, происходящих при ее функционировании. Предпосылкой к такой интерпретации явились рентгеноструктурные исследования фазовых переходов ряда фосфолипидов [308]. Оказалось, что в зависимости от их температуры и концентрации в водных растворах выявляются как ламеллярная фаза, так и гексагонально ориентированные цилиндрические мицеллы. Аналогичные данные на тех же фосфолипидах были получены при их анализе в электронном микроскопе. Стоккениус [494] выявил как ламеллярную, так и гексагональную упаковку фосфолипидных мицелл. Данные, которые трактовались как фазовые переходы из ламеллярной в глобулярную форму, также получены на выделенных плазматических мембранах клеток печени [75]. В процессе фиксации этой фракции при температуре около 2°С выявлялась ламеллярная структура (трехслойное строение), а при 37°С обнаруживалось глобулярное строение исследованных мембран. Указанные температуры совпадали с температурами фазовых переходов фосфолипидов, выявленными рентгеноструктурными исследованиями [308].

Как уже отмечалось, в большинстве случаев обнаруживаемые при электронно-микроскопических исследованиях глобулы интерпретировались как липопротеиновые субъединицы. Действительно, при диспергировании ряда клеточных мембран удавалось показать существование липопротеиновых субъединиц, размеры которых, по данным электронной микроскопии и седимен-тационным свойствам, соответствовали размерам глобул в интактных мембранах под электронным микроскопом. Организация этих глобул трактовалась по-разному [492]. Строго говоря, чтобы принять субъединичную модель мембраны, необходимо было показать наличие функциональных субъединиц и их соответствие морфологическим. Такого рода исследования проводились на различных клеточных мембранах - митохондриальных, саркоплазматического ретикулюма, фотосинтетических и др. Одно из первых доказательств такого соответствия было получено на внутренних мембранах митохондрий, а именно на одном из четырех энзиматических комплексов цепи электронного транспорта - на цитохромоксидазе [206].

Одним из возражений против глобулярной структуры мембран являлись рентгеноструктурные исследования естественных мембранных систем (миелиновая оболочка нервного волокна, светочувствительные элементы клеток сетчатки, мембраны хлоропластов), которые не указывали на существование периодичности в плане мембран. Следует иметь в виду, что отсутствие меридиональных рефлексов, отражающих периодичность в плане мембраны, может указывать лишь на отсутствие строгой (в смысле кристаллической) периодичности [20]. Кроме того, в литературе имеются отдельные рентгеноструктурные исследования, указывающие на существование такой периодичности на мембранах хлоропластов [543] и внешних сегментов светочувствительных клеток сетчатки [85].

Таким образом, имеющиеся факты говорят о том, что ряд мембран (мито-хондриальные, эндоплазматического ретикулюма, бактериальных клеток и др.) организованы из глобулярных субъединиц. В некоторых цитоплазматических мембранах и мембранных комплексах (например, в миелиновой оболочке) такая организация обнаруживается не повсеместно. Это, по-видимому, определяется в большой степени вариацией химического состава и различными функциональными особенностями исследованных мембран. Изложенные представления, касающиеся структурной организации мембран, не учитывают, к сожалению, качественных и количественных вариаций липидного и белкового состава различных мембран. Вместе с тем большинство биохимических исследований указывает на существование таких различий как в плазматических, так и во внутриклеточных мембранах [279, 433]. Не останавливаясь подробно на этом вопросе, приведем лишь несколько примеров. Так, один из важных фосфолипидов - сфингомиелин (он использовался при трактовке фосфоли-пидно-холестеринового комплекса мембран по данным рентгеноструктурного анализа), присутствующий в большинстве плазматических мембран, практически полностью отсутствует в митохондриальных и микросомальных мембранах. Аналогичным образом распределен и фосфотидилсерин. Широко варьирует также содержание холестерина в различных клеточных мембранах. Приблизительно такая же ситуация и с белковым составом мембран. Например, при идентификации протеинов внутренних и внешних мембран митохондрий, гладких и шероховатых мембран эндоплазматического ретикулюма было показано, что только один белок (из 23) аналогичен у внутренних и внешних мембран митохондрий и приблизительно три вида протеинов аналогичны у мембран гладкого ретикулюма и внешних мембран митохондрий [433].

Широко варьирует также относительная площадь, занимаемая белковыми и липидными молекулами в различных клеточных мембранах. В мембранах миелиновой оболочки это отношение не превышает 0.43, в плазматических мембранах гепатоцитов и эритроцитов оно значительно больше - порядка 2.5, а в бактериальных мембранах достигает 5 [279]. Следует также учесть, что при существующих методах выделения мембранных фракций часть гидрофильных белков теряется [14], так что указанные отношения белок-липид в нативных мембранах могут быть значительно выше. Если приведенные данные попытаться связать с тем, что известно о морфологии мембран, то можно заметить, что чем больше количество белка в мембране, тем лучше выражена ее глобулярность. Так, в миелиновой оболочке, судя по электронно-микроскопическим и рентгеноструктурным данным, глобулярность выражена значительно слабее, чем в клеточных мембранах, имеющих большее содержание белков.

Таким образом, краткое рассмотрение некоторых моделей субъединичной организации мембран наряду с анализом их морфологии методом ультратонких срезов указывает на то, что срединная область мембраны состоит из глобулярных белков или липопротеинов, находящихся в липидном матриксе, структура которого в разных мембранах и участках мембран может быть различной и существенно меняться в зависимости от качественного и количественного состава белков и других нелипидных компонентов.

4.4. ЖИДКОСТНО-МОЗАИЧНАЯ МОДЕЛЬ КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНЫ

Эта модель в настоящее время получила наибольшее распространение, так как она согласуется с большинством имеющихся экспериментальных фактов, касающихся структурно-химической и функциональной организации клеточных мембран. Впервые наиболее четко она была сформулирована в работах Зингера и Николсона [472], а затем уточнялась и модернизировалась по мере появления новых экспериментальных фактов [299, 469]. Основная идея этой концепции состоит в том, что биологическая мембрана представляет собой двухмерный раствор интегральных (глобулярных) белков в жидком липидном матриксе. Это значит, что белки и фосфолипиды не представляют собой фиксированных структур, а обладают относительно большой степенью подвижности. Такая модель лучше согласуется с термодинамическими ограничениями и функциональными возможностями биологических мембран. Предполагается, что глобулярные белки, как и фосфолипиды, в которых растворены стеролы [147], имеют структурную асимметрию, т. е. полярные и неполярные концы. Такая структура интегральных протеинов (или гликопротеинов) позволяет разместить большую часть их глобулы внутри мембраны.

Белок-белковые взаимодействия могут осуществляться в этой модели как между периферическими протеинами и внешней поверхностью интегральных белков, так и между субъединицами интегральных белков, образуя специфические агрегаты внутри мембраны. Часть фосфолипидов в жидкостно-мозаичной мембране организована в виде непрерывного бислоя, полярные головки которого обращены к воде. Другая часть связана с протеинами более тесно. Толщина мембраны может варьировать вдоль поверхности от толщины билипидного слоя до величины, равной толщине протеиновой (или гликопротеиновой) области. Как уже указывалось, липиды в данной модели находятся в жидкостном, а не в кристаллическом состоянии. Вместе с тем имеются участки, в которых жидкостность и соответственно подвижность мембранных элементов сильно ограничены. Это в основном специализированные области клеточных мембран с упорядоченной структурой: щелевые (ЩК) и плотные контакты (ПК), бляшки в мембранах галобактерий и др. Эти структуры занимают относительно небольшие поверхности клеточных мембран - от 2% (ЩК гепатоцитов) до 20% (бляшки мембран галобактерий). Показано, что эти специализированные упорядоченные участки клеточных мембран состоят в основном из белков и липидов. Определенным образом направленные белок-белковые взаимодействия между идентичными субъединицами в этих участках мембран индуцируют создание больших агрегатов липидов, расположенных между белковыми субъединицами [469].

Так как основные белки, обеспечивающие транспортные и энзиматические функции, располагаются в других участках мембраны, которые занимают наибольшую часть и обладают достаточной жидкостностью, то наличие небольших специализированных участков с повышенной жесткостью не противоречит гипотезе жидкостно-мозаичной структуры мембран. Подвижность мембранных компонентов может также ограничиваться их взаимодействием с примембранными элементами цитоскелета (см. рис. 2).

Не рассматривая всех экспериментальных данных, согласующихся с жидкостно-мозаичной моделью, укажем лишь на несколько основополагающих фактов, послуживших доказательством ее правомочности. То, что основные химические компоненты могут относительно свободно перемещаться в мембране, было впервые четко показано при анализе распределения антигенов на плазматической мембране гетерокариот [184]. В этих опытах было продемонстрировано, что в первые минуты после сплавления антигенный материал различных клеток располагался изолированно. Однако через 40 мин (при 37°С) происходило полное перемешивание антигенов плазматических мембран. Ингибирование белкового синтеза никак не влияло на конечную картину распределения антигенного материала, которое зависело лишь от температуры. Наблюдаемый эффект, очевидно, обусловлен диффузией мембранного материала. Об этом же говорят данные по электронно-микроскопическому изучению распределения мембранных антигенов эритроцитов человека RH0/D, меченных антителами, конъюгированными с ферритином, и Н2-антигенов гистосовместимости эритро-цитарных мембран мышей [472].

Впоследствии результаты по латеральной диффузии белков были многократно подтверждены и при электронно-микроскопическом анализе перераспределения рецепторов лектинов, эпидермального фактора роста и др. Данные, указывающие на то, что мембранные белки не образуют жесткой структуры, а находятся в относительно подвижном состоянии, получены также при рентгеноструктурном исследовании мембран дисков светочувствительных клеток сетчатки, основной (если не единственный) белок которых - родопсин. Температурная зависимость характера дифракционных картин исследованных мембран позволила заключить, что родопсин в них находится в жидкостноподобном состоянии. Другая серия фактов, послужившая основанием для выдвинутой гипотезы, связана с электронно-микроскопическим изучением клеточных мембран методом ЗСТ. Этим методом было убедительно показано, что интегральные протеины проникают в глубь мембраны или пронизывают ее насквозь. Кроме того, в определенных условиях удается на репликах мембранных поверхностей обнаружить кластеризацию и перераспределение интегральных протеинов (внутримембранных частиц), что хорошо согласуется с ее жидкостностью. Наконец, было показано, что некоторые интегральные мембранные белки (цитохром В5, цитохром В5 редуктаза, гликофорин и др.) амфифильны, что позволяет их гидрофильным группам размещаться на поверхности мембран, а гидрофобным - в ее срединной области [469].

Следует подчеркнуть, что из большого арсенала прямых структурных методов исследования клеточных мембран метод ЗСТ сыграл важнейшую роль в становлении современных представлений об их структурно-химической организации. Перейдем к рассмотрению этих исследований.

4.5 АНАЛИЗ МЕМБРАННЫХ СТРУКТУР МЕТОДОМ ЗСТ

Несмотря на то что метод ЗСТ является относительно трудоемким и требующим для препарирования объектов сложной и дорогостоящей аппаратуры, он получил широкое распространение, особенно для анализа ультраструктуры клеточных мембран.

Липидные компоненты мембран. Имеется ряд серьезных доказательств, что гладкие участки сколотых поверхностей представляют собой разрывы липидного бислоя в местах слабых гидрофобных взаимодействий. Большинство искусственных билипидных мембран выявляют при их исследовании методом ЗС гладкие поверхности. В то же время липиды после быстрого замораживания существенно не меняют молекулярной структуры [203]. Обнаруживаемые методом малоуглового рентгеновского рассеяния изменения липидов модельных мембран при их препарировании для исследования методом ЗС касаются в основном лишь их упаковки в мембране. Площадь гладких участков сколотых поверхностей эритроцитарной мембраны может быть скоррелирована с содержанием в ней липидов (40% по сухому веществу), состоящих в основном из фосфолипидов и холестерина: 1) экстракция липидов ведет к значительному уменьшению гладких участков на их мембранах, 2) увеличение содержания липидов в мембранах эритроцитов человека (у больных с генетическими нарушениями белок-липидного отношения) коррелировало с увеличением гладких мест на их сколотых поверхностях. Однако следует иметь в виду, что отсутствие комплементарности на PF- и EF-поверхностях у большинства клеточных мембран, у том числе и эритроцитарных, указывает на необходимость осторожного отношения к широко распространенному мнению о том, что гладкие области мембран представляют собой отражение ацильных цепей липидных молекул. Следует также учитывать экспериментальные данные о коллапсировании липидов во время скалывания объектов и получения реплик [106, 108, 498]. Значительная энергия, освобождаемая при скалывании замороженных объектов, и некоторый разогрев в процессе оттенения (тепловая радиация), по-видимому, достаточны, чтобы вызвать коллапсирование липидов. Этот эффект также частично объясняет несоответствие размеров и плотностей (количество на единицу площади) выступов и впадин, представляющих собой нелипидные компоненты мембраны (ВМЧ) на PF- и EF-поверхностях [498].

Белковые компоненты мембраны. Имеется большое количество фактов, доказывающих белковую или гликопротеидную природу ВМЧ, которые, вероятнее всего, в центральной (гидрофобной) области мембраны окружены пограничными липидами. Известно, что на сколотых поверхностях мембран (митохондрий, хлоропластов) с высокой метаболической активностью выявляются в большом количестве ВМЧ, в то время как на инертных в этом отношении мембранах миелина обнаруживается относительно мало аналогичных частиц (см. гл. 7). ВМЧ могут быть удалены энзиматическим перевариванием белков [91]. Определенные трудности при таком способе разрушения ВМЧ объясняются плохой доступностью для фермента гидрофобной области мембраны. Наблюдаемая кластеризация ВМЧ, сопряженная с начальным удалением белков, вероятнее всего, относится к энзиматическому перевариванию периферических протеинов типа спектрина.

Данные, согласующиеся с протеиновой природой ВМЧ, получены и в экспериментах по ингибированию белкового синтеза в процессе клеточного роста. В этом случае количество ВМЧ существенно уменьшается. Показано также уменьшение количества ВМЧ на плазматических мембранах клеток, вступающих в фазу, характеризующуюся уменьшением отношения белок-липид [321]. Однако в других работах не отмечалось изменений плотности ВМЧ в процессе клеточного цикла [272]. На мембранах эритроцитарных теней различные поверхностные рецепторы агрегируют одновременно с ВМЧ, что также согласуется с данными о белковой природе ВМЧ. Это было показано на рецепторах АВО-антигенов [386] и конканавалина А [391]. Предполагалось, что мембранно-связанные гликопротеиды ориентированы так, что углеводсодержащие гидрофильные сегменты, в которых локализованы антигенные структуры, и рецепторы обращены во внеклеточную среду, тогда как гидрофобные сегменты взаимодействуют с липидами и интегральными протеинами с формированием ВМЧ на сколах. Следует, однако, указать, что на мембранах интактных эритроцитов ВМЧ не агрегируют вместе с рецепторами конканавалина А [61].

При изучении большинства ядерных клеток в процессе кэппинга рецепторов плазмалеммы агрегаты ВМЧ не выявляются [389]. В литературе неоднократно обсуждалась причина такого рода противоречий. Предполагается, что внутримембранные протеины, с которыми исследуемые рецепторы взаимодействуют, не выявляются в виде ВМЧ из-за малого размера или из-за их особых свойств, которые значительно изменяют эти белки в процессе раскалывания. В то же время мембранные протеины, регистрируемые как ВМЧ, являются протеинами, сильно погруженными в мембрану или пронизывающими ее, и отличаются малым сродством к лигандам [37, 96]. Несмотря на использование ряда нетрадиционных методов, включая "label-fracture" [386], вопрос о соотношении мембранных протеинов и ВМЧ окончательно решить не удалось. Более прямые сведения, указывающие на белковую природу ВМЧ, получены при включении в искусственные фосфолипидные мембраны очищенных мембранных белков. Показано, что ВМЧ появляются только после введения в фосфолипидные мембраны ряда мембранных белков - родопсина [234], кальциевой АТФазы [309], гликофорина [203], белка полосы три [67]. Следует учесть, что данные относительно гликофорина не очень убедительны. Результаты, полученные с введением гликопротеина и белка эритроцитарных мембран, следует обсудить подробнее. При введении в фосфатидилхолиновые мембраны белка полосы три выявляются ВМЧ, по форме и размерам аналогичные ВМЧ эритроцитарных мембран. После встраивания гликофорина в такие же везикулы на сколах обнаруживаются либо мелкие частицы (порядка 4 нм), либо небольшие шероховатости [314].

На основании этих данных было высказанно предположение, что ВМЧ эритроцитарных мембран представляют собой либо белок полосы три, либо комплекс этого белка с гликофорином [92]. В пользу первого предположения говорят данные, полученные на эритроцитарных мембранах, в которых глико-форин отсутствует (эритроциты группы крови Е(а-)). В этих мембранах не было найдено никаких изменений в структуре ВМЧ по сравнению с нормальными эритроцитарными мембранами [62]. В принципе более точные данные могут быть получены при использовании электронно-плотных меток (конъюгированные антитела либо лектины с золотом или с пероксидазой хрена), связывающихся с определенными белками мембраны. Так, при использовании меченых лектинов удалось показать, что ВМЧ, вероятнее всего, является комплексом белка полосы три с гликофорином [92, 391].

Следует, однако, иметь в виду, что электронно-плотные метки связываются с истинной (травленной) поверхностью мембраны, а ВМЧ выявляются только на вскрытых раскалыванием поверхностях. Соответственно не представляется возможным соотнести каждую метку с определенной ВМЧ, что крайне важно для идентификации протеинового компонента мембраны. Обычно исследователи ограничиваются лишь сравнением картины распределения метки с картиной распределения ВМЧ. Зависимость топографии ВМЧ от различных параметров препаровки образцов изучена довольно подробно [350, 527, 528]. Метод, который в принципе позволяет в какой-то мере исключить этот недостаток, - мечение-скалывание (label-fracture), - к сожалению, используется относительно редко, и с его помощью удается исследовать только EF-поверхности плазматических мембран (см. гл. 2). Начато интенсивное изучение интегральных белков с помощью ЗС-цитохимии и ЗС-авторадиографии.

В связи с тем что на репликах эритроцитарных мембран удается выявить по крайней мере два класса внутримембранных частиц (высокие меньшего диаметра и низкие большего диаметра), высказываются соображения о том, что белки полосы три связаны с более высокими ВМЧ. В пользу этого говорят также данные о размерах ВМЧ и белка полосы три [360, 371].

Таким образом, вопрос об идентификации ВМЧ остается до сих пор одним из самых принципиальных и окончательно не решенных. Он решается относительно просто на искусственных реконструированных мембранах, т. е. в том случае, когда известно, какой белок вводится в билипидную мембрану [43]. Однако на интактных биологических мембранах с широким набором различных белков и гликопротеинов задача оказывается чрезвычайно сложной. Наряду сданными, полученными методом ЗСТ, другими методами структурного анализа также показано, что ряд интегральных белков пронизывает мембрану насквозь [84, 220].

Размеры и форма ВМЧ на мембранах различных клеток и на различных участках одной и той же мембраны могут широко варьировать (от 8 до 17 нм). ВМЧ на протоплазматических поверхностях (PF) большинства изученных мембран оказывались значительно меньшего размера, чем на экстрацеллюлярных (EF). Встречаются мембраны, ВМЧ которых достигают 30-35 нм. У значительной части этих ВМЧ обнаруживаются дискретные субъединицы.

В центре ВМЧ на PF- и EF-поверхностях плазматических мембран различных клеток (печени, надпочечников, эндокринных клеток поджелудочной железы, желчных и мочевых пузырей лабораторных животных, эритроцитов кролика) выявляются небольшие углубления, аналогичные хорошо изученным и описанным на глобулах ЩК и представляющие собой гидрофильные участки или каналы [376, 498, 499]. Форма ВМЧ на сколах мембран очень разнообразна. Встречаются глобулярные частицы, квадратные, треугольные [159]. В ряде клеток были выявлены специфические ВМЧ в виде удлиненных стержневидных частиц, иногда представляющих из себя две тесно контактирующие ВМЧ [179]. Наиболее четко они представлены в митохондриальных клетках эпителия мочевых пузырей бесхвостых амфибий [533, 253] и в так называемых темных (вставочных) клетках собирательных трубок почки млекопитающих и амфибий [372, 373]. Поскольку в этих клетках много карбо-ангидразы, то возможно, что большое количество удлиненных частиц коррелирует с наличием в клетках этого фермента. Однако обратная зависимость не выявляется. Например, известно, что в эритроцитах этого фермента много, но частицы, как правило, глобулярные. Было обнаружено большое количество удлиненных ВМЧ в плазматических мембранах клеток собирательных трубок крыс в условиях диеты с дефицитом калия. Такая диета увеличивает секрецию аммония и реабсорбцию калия в исследуемых отделах почки [493]. Показано также, что число темных клеток и соответственно клеточных мембран с удлиненными ВМЧ может быть увеличено и при других экспериментальных условиях [253].

Комплементарные сколы и артефакты препарирования. Несмотря на широкое использование метода ЗС, до сих пор механизм, обеспечивающий раскалывание мембраны и соответственно выявление мембранных поверхностей, до конца не выяснен. Разные авторы интерпретируют сходные картины по-разному в зависимости от выбранной модели мембраны и механизма ее раскалывания. Исходя из представлений о жидкостно-мозаичной модели мембранной структуры [106, 469, 472] и предполагаемых механизмах ее раскалывания [91, 105, 106, 108] можно изобразить события, которые приводят к выявлению мембранных поверхностей при использовании метода ЗСТ (см. рис. 2), в виде следующей модели, представленной на рис. 4 (см. гл. 3).

Внутримембранные частицы на протоплазматической половине мембраны (обозначенные на рис. 4 P1 и Р2) имеют гидрофильную область, выходящую в цитоплазму. Аналогичные области существуют и на ВМЧ экстрацеллюллярной половины мембраны (Е1 и Е2). ВМЧ, пересекающие мембрану насквозь, имеют гидрофильные участки как с цитоплазматической, так и с экстрацеллюлярной стороны. Раскол проходит по наиболее слабым связям (минимум освобождаемой энергии). Видно, что ВМЧ, имеющие по одной гидрофильной поверхности на экстрацеллюлярной или цитоплазматической стороне, остаются после разрыва на соответствующей половине мембраны. Благодаря сильным связям ВМЧ с протоплазматическим и экстрацеллюлярным льдом ВМЧ, пронизывающие мембрану насквозь и имеющие с обеих сторон гидрофильные связи, которые их сильно связывают как с цитоплазмой, так и с экстрацеллюлярным пространством, ломаются посередине.

Возможность разрыва внутримембранных частиц (белков или гликопротеинов) по ковалентным связям была показана при хроматографическом анализе сколотых половинок эритроцитарных мембран [157]. На EF-поверхностях были обнаружены четыре небольших полипептидных фрагмента, что указывало на фрагментацию трансмембранных сиалогликопротеинов по ковалентным связям при скалывании мембраны. Следует отметить, что в нескольких более поздних работах возможность ломки полипептидных цепей при раскалывании эритроцитарных мембран отрицалась [169, 392]. Вследствие сжатия липидов (см. гл. 3, рис. 4) ВМЧ выступают более отчетливо, соответствующие же им углубления, наоборот, выявляются хуже, а если они очень малы, то и вовсе исчезают из-за деформации липидного слоя. Известно, что при глубоком проникновении частиц (например, конексонов в ЩК) действительно хорошо заметны впадины на комплементарных поверхностях. В других мембранах (например, эритроцитарные мембраны) комплементарные впадины видны очень плохо. Глубина проникновения ВМЧ в большой степени определяет наличие на комплементарной поверхности впадины (см. рис. 4). Представленная на рис. 4 (см. гл. 3) чрезвычайно идеализированная (не учитывающая многих артефактов препарирования объектов) схема скалывания мембраны в принципе указывает на то, что классифицировать ВМЧ возможно не только по их размерам, форме и степени агрегации, но и по глубине проникновения, деформируемости и связи с мембранными поверхностями [108].

В большинстве изученных до сих пор плазматических и внутриклеточных мембран различных клеток не удавалось выявить полную комплементарность PF- и EF-поверхностей. Это в большой степени усложняет интерпретацию получаемых картин. В принципе отсутствие комплементарноcnb обусловлено по крайней мере тремя физическими явлениями, имеющими место в процессе препарирования объектов для исследования методом ЗС: 1) при раскалывании возникают пластические деформации, 2) оттенение платиной и напыление угля вызывают увеличение размеров выступающих частиц и уменьшение размеров впадин, 3) расколотые поверхности могут покрываться конденсированными из вакуумного объема загрязнениями (пары воды, углеводороды), которые способны увеличить размеры выступающих частиц и имитировать отсутствующие на исследуемых поверхностях частицы, иногда сходные с истинными внутримембранными частицами (подробнее см. гл. 3).

Следует иметь в виду, что в сложных биологических системах, каковыми являются мембранные структуры, величина деформаций должна зависеть от трехмерной конформации полимерных цепей, их ориентации и локализации по отношению к плоскости скалывания и поверхностных характеристик.

В литературе имеются также данные, указывающие на то, что отсутствие или наличие комплементарности связано с изначальной структурой мембраны, что и определяет характер ее раскалывания при низкой температуре. Так, на мембранах дрожжевых клеток отсутствие каких-либо наблюдаемых деформационных дефектов было продемонстрировано во время их скалывания как при -269°С, так и при -143°С [482]. Вместе с тем на мембранах грамотрицательных бактерий и на плазматических мембранах светочувствительных клеток сетчатки комплементарность двух половин мембран получить не удается [132]. Мы уже говорили о деформационных изменениях белков эритроцитарных мембран, обусловливающих отсутствие в них комплементарности. Другое не менее спекулятивное объяснение высказано в работе Верклея и Ферфергаерта [530]. Эти авторы считают, что во время скалывания белок полосы три, пронизывающий мембрану, испытывает сильные напряжения и вырывается из экстрацеллюлярной половины мембраны, оказываясь целиком на протоплазматической поверхности. Соответственно оказываются сильно измененными как его нативная структура, так и экстрацеллюлярная поверхность мембраны, из которой вырван белок. Вывод об изменении самой мембраны делается на основании того факта, что после длительного травления на экстрацеллюлярной половине появляются углубления. Так как в используемых экспериментальных условиях может возгоняться лишь вода, авторы предполагают, что выявляемые после травления на EF-поверхности углубления представляют собой места вырванного протеина, в которые могла попасть вода из полярных областей мембраны.

Только при полной комплементарности можно говорить об отсутствии деформационных изменений. В большинстве работ, где полная комплементарность была достигнута, сколы осуществлялись не только при сверхнизких температурах, но и в условиях весьма высокого вакуума (1.33•10-7 Па, безмасляные насосы). Если раньше работы в таких условиях проводились лишь на хорошо изученных мембранах дрожжевых клеток, где удавалось получать достаточно полную комплементарность [208, 209], то в последнее время их проводят и на других мембранах. В частности, в лаборатории Робертсона в таких условиях исследовались обогащенные АТФазой мембраны внешнего медулярного слоя почки свиньи [514] и были получены высокоразрешающие картины ВМЧ и соответствующих им углублений на комплементарных репликах. Это по сути дела первая демонстрация полного совпадения индивидуальных ВМЧ с их углублениями в мембранах, содержащих трансмембранный протеин. Полученные данные согласуются с результатами биохимических исследований, указывающих на то, что основная масса Na, K-чувствительной АТФазы локализована в протоплазматической половине мембраны. Следует указать, что когда речь идет о работах, в которых выявляется полная комплементарность, то имеются в виду результаты, полученные на сколах определенных участков мембраны (точно установленных), а не полученные сравнением PF-и EF-поверхностей разных участков мембраны (работ, в которых комплементарность определялась последним способом, достаточно много).

О том, что отсутствие комплементарности в большой степени обусловлено загрязнениями исследуемых поверхностей остаточными парами воды, говорят экспериментальные данные Гросса [208], который показал, что при давлении 1.33•10-4 Па и температуре -100°С вскрытые поверхности могут загрязняться водяными парами в течение 1 с, а при вакууме 1.33•10-7 Па загрязнений в 1000 раз меньше.

Тщательный анализ комплементарных реплик, полученных в самых различных условиях вплоть до сверхнизких температур -269°С и сверхвысокого вакуума 1.33•10-7 Па (10-9 Торр), указывает на три разные картины взаимоотношений выступов и впадин: 1) напротив выступов находятся впадины, 2) напротив выступов отсутствуют впадины, 3) выступам соответствуют выступы. Первые две картины хорошо согласуются с представлениями о жидкостно-мозаичной модели мембран, которая предполагает различное погружение белков в липидный матрикс вплоть до пересечения мембраны насквозь. Картины, указывающие на наличие выступов против выступов, могут быть обусловлены деформацией белковых компонентов, пересекающих мембрану или глубоко в нее внедряющихся. Вместе с тем не следует забывать, что при исследовании мембран методом ЗСТ анализ изображения проводится на замороженных объектах, т. е. в условиях, не соответствующих их нативному состоянию, и соответственно внутримембранные связи могут значительно изменяться (табл. I)( Электронно-микроскопические фотографии см. на вклейках.).

Распределение внутримембранных частиц в плоскости мембраны. В большинстве случаев ВМЧ распределены на мембранных поверхностях статистически равномерно, что, возможно, соответствует условной физиологической норме. Плотность ВМЧ значительно варьирует в зависимости от функционального состояния исследуемых клеточных мембран. Это хорошо продемонстрировано на клетках нефрона млекопитающих. В зависимости от степени реабсорбции и секреции клеток различных отделов нефрона меняется плотность ВМЧ в их плазматических мембранах [373]. Отклонения от равномерного распределения, как правило, выражены в некоторых специализированных участках плазматических мембран: например, очень плотная, иногда упорядоченная организация ВМЧ (коннексонов) в ШК, относительно плотное расположение частиц в десмосомах, организованные ряды частиц в ПК (см. гл. 6). Реорганизация ВМЧ на клеточных мембранах описана при слиянии клеток под воздействием различных агентов, при слиянии мембран внутриклеточных структур между собой и с плазматической мембраной, экзоцитозе, эндоцитозе. В большинстве случаев сливаемые участки мембран освобождаются от внутриклеточных частиц. Существует ряд фактов, указывающих на то, что при сплавлении мембранные белки диффундируют в соседние участки, а сплавляются липидные области. Однако такая ситуация не является повсеместной. Описаны случаи, когда слияние внутриклеточных мембранных образований с цитоплазматической мембраной сопровождается образованием розеток ВМЧ [430].

Кластеризация ВМЧ выявляется на плазматических мембранах в процессе взаимодействия клеточных рецепторов с лигандами. Образование крупных агрегатов ВМЧ было многократно продемонстрировано на плазматических мембранах клеток "непроницаемых" эпителиев при стимуляции водного потока антидиуретическим гормоном (АДГ, см. раздел 8. 7). Работа, Шевалье с соавторами [128] послужила началом целого направления в исследованиях функционально значимых агрегатов ВМЧ. Впоследствии было высказано предположение о том, что ВМЧ, образующие под действием АДГ агрегаты, являются каналами, осуществляющими трансмембранный перенос воды. Хотя эта точка зрения подвергается серьезной критике, большинство авторов считают, что области, занятые агрегатами ВМЧ, являются участками существенно большей водной проницаемости, чем остальная часть мембраны [19, 255, 533].

Механизм перераспределения ВМЧ до сих пор остается неясным; предполагается, что наряду с латеральной и трансмембранной диффузией белковых компонентов в липидном матриксе важное значение в этом процессе имеют элементы примембранного цитоскелета. Наиболее существенные доказательства их участия получены на эритроцитарных мембранах. Показано, что ВМЧ могут агрегировать лишь в тенях или везикулах, в которых количество белка цитоскелета - спектрина сильно уменьшено, и области, занятые агрегатами, совпадают с зонами агрегации спектрина, а введенные в тени антитела к спектрину вызывают кластеризацию мембранных гликопротеинов [364, 460]. Известно также, что удаление спектрина [196] или его перемещение [173] значительно увеличивает скорость латеральной диффузии интегральных протеинов.

Имеется много работ, проведенных на других (не эритроцитарных) клетках, в которых показаны заякоривание белков плазмалеммы элементами цитоскелета [363] или интимная связь последних с цитоплазматической поверхностью мембраны [366]. Агрегация ВМЧ также может определяться состоянием липидных компонентов мембраны. В эритроцитах больных с холестазом, мембраны которых обогащены холестерином и фосфатидилхолином, выявляются как пониженная плотность ВМЧ, так и их агрегация [530]. Известно также, что действие филипина (см. раздел 2.3) индуцирует образование агрегатов ВМЧ. Кроме того, наряду с взаимодействием спектрина с белковыми компонентами мембраны имеют значение также и взаимодействия цитоскелета с липидами.

Не останавливаясь на других примерах перераспределения, кластеризации и агрегации ВМЧ, сопряженных с теми или иными воздействиями, рассмотрим некоторые факты, указывающие на возможность артефактного возникновения такого рода картин. В том случае, когда исследуемые клетки по каким-либо причинам медленно охлаждаются ниже температуры фазового перехода липидов до их быстрого замораживания для последующего анализа методом ЗС, в их мембранах выявляются агрегаты ВМЧ. Одной из таких причин может быть медленное погружение объектов в охлаждающий агент (пропан, изопентан и др.). Механизм агрегации ВМЧ в этом случае довольно прост. Липиды образуют ограниченные домены, аналогичные кристаллам льда, а внутримембранные частицы собираются вокруг них в эвтектической зоне [211].

Агрегация ВМЧ коррелирует с фазовыми переходами липидов, обнаруживаемых методами ядерно-магнитного резонанса, дифференциальной сканирующей колориметрии и рентгеноструктурного анализа [529]. В некоторых случаях агрегаты ВМЧ не наблюдались, хотя фазовые переходы липидов регистрировались. Предполагается, что такая ситуация возможна в случае мембран с большим содержанием разветвленных липидных цепей [212]. В некоторых из исследованных на этот предмет мембран не удавалось наблюдать ни фазовых переходов, ни агрегатов ВМЧ (в частности, на богатых холестерином мембранах лимфоидных клеток млекопитающих [550]).

Агрегация ВМЧ, сопряженная с фазовыми переходами липидов, является процессом реверсивным, и при повышении температуры выше фазового перехода агрегация ВМЧ исчезает. С этой точки зрения наблюдаемые эффекты агрегации ВМЧ могут быть использованы для определения состояния мембранных липидов.

Другой тип агрегации внутримембранных частиц, не связанный с физиологическим состоянием клеток, обусловлен введением глицерина (см. гл. 3). Вызванная таким способом агрегация исчезает, если вымыть криопротектор. Ее можно исключить предварительной фиксацией материала глютаральдегидом [322]. Следует, однако, иметь в виду, что для некоторых мембран (мембраны миелина, перибактериальные мембраны) префиксация не всегда предохраняет ВМЧ от агрегации, обусловленной глицеринизацией [108, 390]. Возможно, что в этих случаях агрегация зависит от времени фиксации и глицеринизации. Если после быстрой фиксации объект немедленно глицеринизировать, то агрегации можно избежать. Тем не менее эффект глицеринизации (особенно если он маловыразителен) трудно исключить. Контрольные опыты (фиксация без глицеринизации) представляют часто непреодолимые трудности, связанные с необходимостью огромных скоростей замораживания объектов. Мембраны, в которых фиксация не предотвращает агрегацию, вызванную глицеринизацией, характеризуются высоким отношением липид-белок. Не исключено, что в этих мембранах относительно мало поверхностных белков, заякоривающих внутримембранные частицы, которые могут поперечно связываться фиксатором. Принято считать, что глютаровая фиксация, используемая в методе ЗС, стабилизирует мембранные структуры клетки. Учитывая все вышесказанное, следует иметь в виду, что не во всех случаях это так.

Цитохимический анализ мембранных поверхностей. Метод ЗС до сих пор в большинстве случаев используется для анализа геометрического рельефа исследуемых мембранных поверхностей. Несмотря на постоянное совершенствование этого метода", функциональное значение выявляемых им тонких деталей остается неясным. Соответственно их непосредственная химическая идентификация является необходимым условием для понимания структурных основ функционирования клеточных мембран. Значительный вклад в этом направлении был сделан благодаря использованию конъюгированных антител и лектинов с ферритином и пероксидазой хрена, реконструкции мембран из известных химических компонентов, а также методам авторадиографии.

Наибольший прогресс связан с привлечением в последние годы новых цитохимических методов, позволяющих локализовать на вскрытых методом ЗС поверхностях белковые и липидные компоненты. При рассмотрении полученных этими методами результатов мы постараемся критически оценить недостатки и сомнительные стороны такого рода исследований [498].

Локализация стеролов. Результат выявления стеролов в клеточных мембранах филипином и сапонинами указывает на то, что их распределение в плане мембраны не гомогенно. Примеров такого гетерогенного распределения стеролов в плазматических и внутриклеточных мембранах различных клеток и тканей много. Они достаточно полно собраны (включительно до 1982 г.) в обстоятельном обзоре Северса и Робенека [444]. Хотя плотность ФСД (количество дефектов на единицу площади) на плазматических мембранах различных клеток сильно варьирует, она, как правило, значительно выше плотности ФСД на внутриклеточных мембранах: на поверхностях цистерн пластинчатого комплекса (Гольджи), отходящих от него везикул и конденсированных вакуолей, а на мембранах эндоплазматического ретикулюма, ядер и митохондрий плотность дефектов значительно ниже (табл. II-IV). Приведенные результаты ультраструктурного анализа распределения холестерина достаточно хорошо коррелируют с биохимическими данными по содержанию холестерина в указанных мембранных фракциях и соответственно являются достаточно надежными. К сожалению, такая корреляция наблюдается не всегда. Например, в плазматических мембранах экзокринных клеток поджелудочной железы выявляется очень мало ФСД по сравнению с мембранами секреторных гранул [374], а в ядерных мембранах некоторых типов клеток обнаруживается необычно много дефектов.

Характер распределения ФСД может быть самым различным. Они выявляются в виде единичных дефектов или группами с тесной упаковкой. Различное распределение ФСД в плазматических мембранах полярных клеток в большей степени определяется их специфическими областями - апикальной, латеральной, базальной, что было убедительно показано на подоцитах почки, гранулярных клетках мочевого пузыря амфибий, гепатоцитах в культуре [370, 372, 416, 444].

Большинство исследований по распределению стеролов в клеточных мембранах не учитывает функционального состояния клеток и тканей. Вместе с тем, как это следует из анализа плотности ФСД на плазматических мембранах гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки при различных по величине водных потоках, функциональное состояние клеток оказывает значительное влияние не только на локализацию холестерина в пределах плазматических мембран, но и на его распределение между их экстрацеллюлярными и цитоплазматическими половинами. Анализ распределения плотности ФСД на поверхности апикальных мембран гранулярных клеток при исходно низкой водной проницаемости мочевого пузыря выявил два типа клеток, отличающихся по плотности дефектов и их направленности. В первом типе клеток плотность дефектов на 1 мкм2 составляла 162╠11 в то время как на поверхности аналогичных мембран клеток второго типа - 99╠10. Клетки второго типа встречаются относительно редко. Базолатеральные мембраны обоих типов клеток по сравнению с апикальными содержат большее количество холестерина (плотность дефектов 270╠10 на 1 мкм2). Исключение составляли лишь области ПК, в которых ФСД отсутствовали. В базолатеральных областях плазматических мембран выявляется различная направленность дефектов: на PF-поверхностях значительно больше выступбв, а на EF-поверхностях - впадин. В отличие от базолатеральных мембран на апикальных мембранах большинства гранулярных клеток филипиновые дефекты направлены в сторону экстрацеллюлярного пространства.

При стимулировании АДГ водного потока картина распределения ФСД меняется. На апикальной мембране, наряду с уменьшением плотности дефектов, утрачивается и их однонаправленность: выступы и впадины обнаруживаются как на EF-поверхности, так и на PF. Базолатеральные мембраны в условиях высокой водной проницаемости претерпевают следующие изменения - плотность дефектов уменьшается и они приобретают однонаправленность (деформации направлены в экстрацеллюлярное пространство). Интерпретация картин изменения плотности и направления ФСД на плазматических мембранах гранулярных клеток при усилении водных потоков сложна и требует постановки дополнительных экспериментов (табл. II-IV и V, в). Возможно, что обнаруживаемые изменения распределения холестерина при стимуляции водного транспорта АДГ в базолатеральной мембране могут быть обусловлены ее растяжением при набухании клеток, а в апикальной - встраиванием в нее мембран агрефоров.

Большинство исследователей выявляемые ФСД явно или не явно связывают с прямым отражением распределения стеролов в мембранах. По ряду причин надежность такой интерпретации не всеми принимается. Дело в том, что опыт работы этими методами относительно мал, мало и количество работ, в которых проводились бы тестирующие эксперименты. Имеется всего несколько примеров независимой морфологической оценки распределения филипиновых и сапониновых дефектов и биохимических измерений стеролов в соответствующих мембранных фракциях. Показано, что десмосомы и окаймленные ямки нечувствительны к филипину и сапонинам [342], этот факт согласуется с малым содержанием холестерина во фракциях изолированных десмосом [480] и окаймленных пузырьков [379]; данные по другим специализированным участкам плазматической мембраны разноречивы и трудно интерпретируемы. Области ЩК, как правило, нечувствительны к филипину. Вместе с тем биохимические данные относительно выделенных ЩК указывают на сравнительно высокое содержание в них холестерина [219]. Другой характерный пример несоответствия цитохимических и биохимических данных по содержанию холестерина - это пластинки с гексагональной упаковкой ВМЧ апикальной мембраны эпителиальных клеток мочевого пузыря млекопитающих. Несмотря на то что они дают отрицательный ответ на филипин, биохимический анализ выделенных фракций этих пластинок указывает на богатое содержание в них холестерина (см. раздел 8.7).

В связи с тем что современные методы выделения отдельных мембранных фракций не гарантируют их чистоты и соответственно существуют собственные нерешенные биохимические проблемы оценки состава исследованных фракций, указанные выше расхождения между морфологическими и биохимическими данными говорят о необходимости осторожной, корректной и критической интерпретации результатов, получаемых рассматриваемыми цитохимическими методами. Исходя из механизмов действия используемых для выявления стеролов агентов можно думать о влиянии ряда структурных факторов на их проникновение, агрегацию первичных комплексов со стеролами или деформацию мембран. Наиболее существенными являются фазовое состояние липидов и характер упаковки внутримембранных частиц. На основании общих соображений можно считать, что в мембранных доменах, содержащих липиды в гелевой фазе или плотно упакованные белковые компоненты, возникновение видимых в электронном микроскопе деформаций маловероятно. С другой стороны, филипин не может вызвать деформацию в отсутствие 3?-гидроксистерола, а на модельных системах была продемонстрирована корреляция между плотностью дефектов и количеством в них стеролов [180, 181].

Таким образом, проблема интерпретации результатов цитохимического анализа стеролов больше связана с участками мембран, в которых дефекты отсутствуют, чем с местами, в которых они хорошо выявляются. Необходимо отметить, что гладкие области мембран, в которых отсутствуют ВМЧ, особенно чувствительны к обработке филипином. Показано также, что при экспериментально индуцированной агрегации ВМЧ эритроцитов образующиеся обширные гладкие зоны склонны к повышенной чувствительности к филипину по сравнению с мембранами нормальных эритроцитов [101]. Вместе с тем в экспериментах по фазовому разделению липидов в доменах с высокой плотностью ВМЧ дефекты практически не выявляются [444]. Судя по ряду экспериментальных работ, негативное влияние на выявление стеролов с помощью филипина оказывают примембранные элементы цитоскелета [163]. Хотя механизм этого явления не выяснен, предполагается, что опорные фибриллярные элементы, примыкающие к мембране, противодействуют ее деформациям и соответственно образованию ФСД. В заключение выскажем несколько практических рекомендаций, касающихся анализа распределения стеролов рассматриваемыми методами: 1) в случае отрицательного действия филипина следует использовать сапонины (предпочтительный томатин); 2) отрицательный ответ на сапонины должен быть проверен филипином; 3) дополнительные возможности дают эксперименты с двойной меткой (филипин и томатин) и с энзиматическим удалением мембранных компонентов [163].

Выявление анионных липидов. Хотя исследования по распределению анионных липидов на эукариотических клетках начаты более 10 лет назад [71,

130], тем не менее работ, в которых бы проводился корректный анализ локализации анионных липидов на плазматических мембранах эукариотических клеток с помощью полимиксина В, до сих пор очень мало. Ряд причин обусловливает такую ситуацию: 1) вариабельность размеров и форм мембранных дефектов, образующихся при взаимодействии полимиксина В с анионными липидами; 2) необходимость обработки исследуемых объектов полимиксином в нативном (не фиксированном) состоянии; при такой обработке обнаруживаются довольно сильные разрушения клеточных структур, что вызывает сомнения, является ли полимиксин хорошим маркером анионных липидов в нативных мембранах; 3) в литературе практически отсутствуют данные, касающиеся влияния условий обработки клеток полимиксином В, оказывающих воздействие на количество и форму вызываемых деформаций - рН, ионная сила, концентрация, температура, время инкубации [444] (табл. V, г).

Анализ распределения белковых и гликопротеидных элементов мембраны. Локализация отрицательно заряженных мест и рецепторов лектинов на ES-noверхностях была продемонстрирована с помощью комбинации метода ЗСТ и технологии афинной гистохимии [392-394]. К сожалению, такой подход имеет ряд серьезных ограничений. Он дает удовлетворительные результаты в основном на одиночных клетках в суспензии и на монослоях клеточных культур, т. е. в условиях, когда сублимация поверхностного материала не слишком затруднена. Однако и в этих случаях удается вскрыть лишь небольшие участки плазматической мембраны. При использовании тканевых объектов ситуация сильно усложняется, так как большинство клеточных поверхностей оказываются закрытыми несублимируемым материалом, пропитанным криопротектором. Эту проблему удалось в определенной степени решить благодаря введению улучшенных способов сверхбыстрого замораживания, не требующих использования криопротекторов (см. гл. 1). Метод меченых сколов с использованием коллоидного золота также применяется в основном для анализа распределения белковых и гликопротеидных элементов на экстрацеллюлярных поверхностях плазматических мембран свободно живущих [385] и культуральных клеток [37, 87] (табл. V, а и б). Это единственный метод, позволяющий точно соотнести внутримембранные частицы с введенной меткой. Следует отметить, что работ, выполненных этим методом, относительно мало и они носят в основном методический характер. Это в большой степени определяется сложностью и трудоемкостью самого метода. Однако, учитывая его преимущество по сравнению с другими цитохимическими методами анализа клеточной поверхности, он, вероятно, найдет в ближайшем будущем широкое применение.

* * *

Учитывая определенную методическую направленность книги, основное внимание уделяется фактам, полученным методом ЗСТ. Так как основные идеи, позволяющие интерпретировать выявляемые этим методом картины ультраструктурной организации мембран, были взяты из исследований, выполненных как другими электронномикроскопическими методами, так и рядом физико-химических методов, некоторые из этих работ также рассматриваются и обсуждаются. Полные сведения об этих исследованиях можно найти в вышедших за последние годы многотомных изданиях, охватывающих практически все современные проблемы структурной и функциональной организации клеточных мембран [327, 498].

При рассмотрении данных по структуре клеточных мембран, полученных методом ЗС, мы учитывали, что при всех достоинствах этого метода исследуемые реплики сколотых поверхностей мембраны получены с замороженных объектов, физическое состояние которых не является нативным. Кроме того, все процедуры подготовки объектов этим методом таят в себе много возможных воздействий, искажающих истинное отображение исследуемых мембран. Вследствие этого много внимания уделено вопросам, касающимся неоднозначности интерпретации выявляемых картин, что обусловлено в большой степени артефактами препарирования. В частности, это касается анализа комплементарных сколов, позволяющего в ряде случаев выявить артефактные структуры и понять причину их возникновения.

Наиболее остро вопрос об отсутствии единой трактовки выявляемых картин встает при цитохимическом анализе клеточных мембран методом ЗСТ. Мы попытались рассмотреть большинство из известных в настоящее время причин, обусловливающих такую ситуацию, и в тех случаях, когда это возможно, предложить способы их устранения.

Несмотря на то что используемые до сих пор цитохимические методы ЗСТ сложны и не всегда хорошо воспроизводимы, они, по-видимому, будут в скором времени улучшены и найдут более широкое применение. Именно от них в большой степени зависит прогресс в понимании структурно-химической организации клеточных мембран.


## Глава 5

(Глава написана в соавторстве с В. А. Мироновым.). МЕМБРАНЫ КЛЕТОЧНЫХ ОРГАНОИДОВ. ЦИТОСКЕЛЕТ

Приступая к изложению общих закономерностей строения клеточных органоидов, мы считаем необходимым еще раз упомянуть о существующей номенклатуре мембран при их анализе методом ЗСТ. Для внутриклеточных структур универсальным остается правило, согласно которому слои мембран, прилежащие к цитоплазматическому матриксу, содержимому ядра и матриксу митохондрий, обозначаются на сколах как PF-поверхности, а контактирующие с межмембранным пространством митохондрий, полостями цистерн карио-теки, цитоплазматической сети, пластинчатого комплекса (Гольджи), лизосом, секреторных гранул - как EF-поверхности [90] (см. рис. 2). Различные клеточные мембраны существенно отличаются друг от друга по составу липидов, в частности стеролов (см. таблицу). В процессе функционирования клетки постоянно происходит слияние мембран различных клеточных органоидов как между собой, так и с плазматической мембраной. Механизм слияния сложен и не решен окончательно, поэтому требует отдельного рассмотрения.

5.1. СЛИЯНИЕ МЕМБРАН

Слияние мембран - фундаментальный биологический процесс, имеющий жизненно важное значение для самых различных клеточных функций. Следует отметить, что понятия "слияние мембран" и "разрыв слившихся мембран" существенно отличаются. Поэтому целесообразно говорить о стабилизированном слиянии мембран (слиянии мембран без разрыва общего листка в зоне контакта) и о полном слиянии (слиянии, приводящем к элиминации вещества мембраны или реорганизации ее в зоне контакта). От процесса расхождения слившихся мембран необходимо отличать отрыв мембранных пузырьков с соответствующей реорганизацией шейки. По мере того как становились известными все более интимные механизмы, вызывающие или блокирующие слияние мембран, разрабатывались все новые гипотетические модели этого процесса. Как правило, они базировались на соответствующих по времени их создания гипотетических моделях строения мембран, поэтому мы не будем здесь подробно их разбирать (подробнее см. обзоры [327, 328]).

Пополнение знаний о строении биологических мембран и модельные эксперименты на искусственных мембранах показали, что слияние мембран происходит в три стадии: адгезия, присоединение, слияние. При этом на 1-й стадии на сколе видны отдельные гладкоконтурные возвышения, во время 2-й стадии видны углубления и выпуклости, образовавшиеся при скалывании мембранных пузырьков. Во время 3-й стадии на сколе образуются кратеры и углубления с ровным дном [527].

При слиянии мембран во время секреторного процесса гранулы примыкают к плазмалемме, которая выгибается и приспосабливается к кривизне подлежащей гранулы. Принципиально важным моментом является вопрос о том, очигдаются ли эти выступающие районы тесного мембранного контакта полностью или частично от ВМЧ, которые обнаруживаются в возрастающей концентрации вокруг краев выступов плазмалеммы и скапливаются в ограниченных зонах "нормальной" мембраны, оставшейся между смежными выступающими участками.

Ранее считалось, что необходимой предпосылкой для слияния мембран является удаление большинства (если не всех) мембранных белков из обоих участвующих в процессе слияния липидных слоев. Эта идея получила свое развитие в ряде исследований [458], Существовало также мнение [306, 437], что упрощение строения мембран с перераспределением холестерина характеризует их подготовку к слиянию. Однако при использовании сверхбыстрого замораживания было обнаружено, что очищения мембраны от ВМЧ не происходит [126, 527]. Остается, однако, до сих пор неясным, начинается ли слияние с одной точки касания мембран (см. ниже), или в этом процессе задействовано несколько точек слияния (как это показано с помощью сверхбыстрого замораживания) и могут возникать не одна пора, а несколько.

Многие параметры процесса слияния зависят от физико-химических свойств бислоя липидов в мембране. Известно, что бислой не является единственной устойчивой упаковкой липидных молекул. Описаны другие состояния липидных молекул, из которых наиболее интересной с точки зрения слияния мембран является так называемая гексагональная упаковка второго типа (Нп) (рис. 6) [527]. Предполагается, что она локально и временно формируется при слиянии бислойных липидных мембран. Обнаружено довольно много веществ, которые в естественных условиях иногда встречаются в мембранах в значительных концентрациях. В чистом виде они "предпочитают" находиться в гексагональной или в какой-то другой фазе, но не в виде бислоя. К ним можно отнести, например, фосфатидилэтаноламины и кардиолипиды. Холестерин при определенных ситуациях также имеет тенденцию к формированию гексагональной фазы (Нп). Предполагается, что эти вещества либо накапливаются в больших количествах во всей мембране, либо концентрируются в определенных районах, что облегчает процессы слияния.

Содержание стеролов в мембранах по результатам реакции с филипином и сапонинами (по [444])


Изучаемая структура


Реакция


с филипином


с сапонинами


Митохондрии


-


-


Гладкая ЦПС


-


-


Саркоплазматическая сеть в сердечной мышце


+ -


?


Гранулярная ЦПС:


эпидермис, печень


-


-


в культуре клеток


+ -


?


Пластинчатый комплекс (Гольджи):


созревающая часть


-


?


дифференцированная часть


+


?


везикулы, производные комплекса


+


+


Окаймленные везикулы


-


-


Кариотека:


гепатоциты, миоциты, призматический эпителий


+ -


+ -


эндотелий капилляров, эпителий мочевого пузыря


+


?


Места слияния мембран


+


??


Область ЩК


-


-


Фибрилла ПК


-


-


Межфибриллярная мембрана в ПК


+ -


+ -


Область десмосомы


-


-


Места формирования ЩК и ПК


-


-


Активная зона пресинаптической мембраны


-


??


Скопления рецепторов на постсинаптической мембране


-


-


Область ожерелья реснички


-


??


Апикальные бляшки, ВМЧ млекопитающих


-


+


Примечание. (?) - нет данных, (??) - данные противоречивы, ( + ) - реакции положительная, (-) - реакция отрицательная, (+ -) - реакция выражена слабо.


Рис. 6. Схема реорганизации липидного бислоя при слиянии мембран.

а - слипание; б - образование гемимицеллы (НII-фазы); в - слияние.

Большинство клеточных мембран содержит существенное количество липидов, для которых НII-фаза является термодинамически более устойчивой. Поэтому в клеточных мембранах присутствуют факторы, которые блокируют локальные тенденции к переходу в НII-фазу. К блокирующим механизмам можно отнести, во-первых, стерические препятствия, возникающие из-за взаимодействия липидов с протеинами, а во-вторых, мембранные белки (клатрин, спектрин, актин и др.), находящиеся на внутриклеточной поверхности, и параплазмалем-мальные белки - на внеклеточной. Из-за особенностей строения гликокаликса слияние мембран в живых тканях, как правило, осуществимо только между гомологичными клетками. Существование указанных механизмов подтверждено в экспериментах, в том числе на модельных мембранных системах. Например, агрегация рецепторных протеинов с помощью лектинов индуцирует переход липидов в НII-фазу и слияние мембран. Об аналогичности процессов перехода липидов из бислойной структуры в НII-фазу и слияния мембран свидетельствует то, что они индуцируются одними и теми же факторами, включая ионы кальция и фосфата, изменение рН, добавление пептидов, некоторых липидов (фосфатидилсерина, фосфатидилхолина, моноглицеридов, жирных кислот и др.). Многие факторы действуют аддитивно. Например, присоединение ионов кальция к фосфатидилсерину приводит к тому, что стабилизация бислоя с помощью отрицательно заряженных липидов, например фосфатидилэтаноламина, теряется. Тем самым ионы кальция косвенно способствуют проявлению тенденции к переходу фосфатидилэтаноламина в НII-фазу [527].

Значительна роль ионов кальция и в механизмах слияния клеточных мембран. Повышение внутриклеточного уровня ионов кальция может, видимо, влиять на процессы слияния мембран двояким способом: прямо, путем изменения или облегчения фазовых переходов липидов, и косвенно, через активацию мембранно-ассоциированной системы цитоскелетных элементов. Возможность того, что ионы кальция могут менять конфигурацию ВМЧ, также надо учитывать [382]. Не исключено, что ионы кальция вызывают перераспределение ВМЧ через актин-мозиновую систему. При вхождении кальция в клетку происходит перемещение цитоплазмы и мембранных протеинов. Этот процесс, связанный, вероятно, с сокращением микрофиламентов, обеспечивает возможность соприкосновения мембран, их слияния и выброса содержимого во внеклеточное пространство [256]. Некоторые другие факторы также стимулируют процесс слияния клеточных мембран: электрический ток, протеиназы и продукты протеолиза, ряд криопротекторов (диметилсульфоксид, глицерин, полиэтиленгликоль) и вирусы [306]. Действие вирусов сопровождается различными формами реорганизации мембран [398].

В настоящее время ни у кого не вызывает сомнений, что в клетке постоянно происходит кругооборот мембран (рециркуляция). Например, одна из основных функций пластинчатого комплекса связана с этим процессом мембранного обновления. Лизосомы, по-видимому, играют важную роль в переработке захваченных мембран и содержимого мембранных вакуолей в процессе рециклинга клеточных мембран. Ясно, что мембранная рециркуляции есть совокупность процессов, реализация которых требует транзиторного слияния мембран. С этой точки зрения, между процессом рециркуляции и процессами экзоцитоза (секреции и дегрануляции) и эндоцитоза (фагоцитоза и пиноцитоза) нет принципиального различия.

Выдвинута гипотеза о постоянном движении доменов мембран, содержащих рецепторы. После эндоцитоза (интернализации) эти домены возвращаются в плазмалемму. Процесс рециркуляции рецепторсодержащих участков мембран (интернализация, обратное слияние и встраивание) зависит от многих параметров (рН. температуры, текучести мембран и др.) .[192].

Для эндоцитоза характерно возникновение локальных концентраций ВМЧ. Показано, что в фагоцитирующих макрофагах происходит перераспределение ВМЧ и формирование кластеров. В последующем формировании кавеол участвуют элементы рецепторно-цитоскелетного комплекса [192]. Например, при разрушении примембранного цитоскелета нарушаются процессы секреции и фагоцитоза. Разрушение микротрубочек препятствует дегрануляции тучных клеток. Для образования межклеточных контактов, равно как и для прикрепления клеток к субстрату, требуется концентрация фибриллярных элементов в зоне контакта [432]. Вероятно, будущие модели процесса слияния мембран будут учитывать состояние и распределение фибриллярных мембранно-ассоциирован-ных структур клетки. Знание молекулярных основ слияния мембран позволит, по-видимому, в дальнейшем управлять этим процессом.

Имеется принципиальная возможность разработки методов поставки веществ внутрь клетки с помощью липосом, основанная на их способности к слиянию с клеточными мембранами. Придавая определенные свойства липосомам, можно направленно переносить необходимые вещества к определенному органу, в частности транспортировать генетический материал к ядру, меняя тем самым клеточный генотип. Еще один пример: известно, что тучные клетки выбрасывают универсальные внутритканевые регуляторы - биогенные амины (гистамин, серотонин) и гепарин; управление выбросом этих веществ, реализуемое через механизм слияния мембран, возможно, позволит целенаправленно лечить разного рода аллергические и стрессовые состояния, сопровождаемые выбросом биогенных аминов в ткани. Работы в этом направлении могут стать одним из перспективных направлений клеточной фармакологии.

Таким образом, уже сейчас видны громадные перспективы для выхода в практику теоретических исследований по механизму слияния мембран.

5.2. СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ УЧАСТКИ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ

Плазмалемма клеток в ряде случаев образует специализированные структуры, имеющие важное функциональное значение в процессах всасывания, движения, рецепции и т. д. (табл. VI - VIII). Плазматическая мембрана, покрывающая эти образования, имеет определенные структурные особенности. Например, на PF-поверхности микроворсинок щеточной каемки энтероцитов и нефроцитов обнаруживается большое количество ВМЧ, что отражает наличие значительного содержания интегральных протеинов - ферментов, участвующих в реализации мембранного пищеварения. Эти частицы на везикулах, полученных из мембран микроворсинок, часто образуют агрегаты [414].

Своеобразные структуры обнаружены на мембранах основания реснички. На PF-поверхности ВМЧ образуют 3-8 (в зависимости от органа) ожерелий, представляющих собой одиночные ряды частиц, полностью охватывающих окружность реснички. Значение их пока неясно.

Кроме вакуолей - производных пластинчатого комплекса, имеющих, как правило, диаметр более 100 нм, - во многих клетках в больших количествах встречаются микровезикулы - мембранные пузырьки, размер которых колеблется от 50 до 100 нм. Плоскость скола никогда не пересекает эти пузырьки, всегда огибая их с той или другой стороны. Определенная часть этих пузырьков прилежит к плазмалемме, нередко сливаясь с ней. Эти образования получили название кавеол, или прикрепленных микровезикул. Среди последних четко определяются две популяции: окаймленные и неокаймленные. Первые при прохождении скола по гидрофобной области плазмалеммы в большинстве случаев дают куполообразные возвышения на EF-поверхности и округлые ямки на PF. Лишь в том случае, когда имеется узкая шейка, соединяющая окаймленную везикулу с плазмалеммой, скол проходит через шейку. Последний механизм является главным для неокаймленных везикул или кавеол. При этом обнаруживаются кратерообразные возвышения с ровной площадкой на вершине на EF-поверхности скола и покатое углубление с плоским дном (площадкой) на PF (механизм формирования скола см. рис. 7). Указанные площадки соответствуют наиболее узкой части кавеол и имеют размеры 20-40 нм, что существенно меньше диаметра самих везикул [463]. На поперечных к плазмалемме разломах часто хорошо различимы тело и шейка везикулы.

Рис. 7. Схема прохождения раскола в периферической зоне эндотелиоцита и образования сколов микровезикул, фенестр и пор на PF- и EF-гюверхностях базальной и люминальной областей плазмалеммы.

Прерывистой линией показано прохождение скола; 1 - оставшаяся часть плазмалеммы и 2 - оставшаяся часть цитоплазмы эндотелиоцита после удаления сколотой части; а - кавеола (углубление с плоским дном, или ямка) на PF; б - скол окаймленной везикулы на EF базальной плазмалеммы, куполообразное возвышение; в-г - скол кавеолы на EF базальной плазмалеммы, низкое кратерообразное возвышение с плоской площадкой (в) и высокое кратерообразное возвышение (г); д - скол фепестры на EF базальной плазмалеммы, кратерообразное возвышение; е-переход линии скола с EF базальной плазмалеммы на PF люминальной; ж - скол фенестры на PF люминальной плазмалеммы, углубление с плоским дном; з - скол поры на PF люминальной плазмалеммы, мелкое углубление с плоским дном; и - варианты прохождения скола через пору, переход скола с EF базальной плазмалеммы на PF люминальной.


Следует подчеркнуть, что сколы кавеол на репликах во многом напоминают сколы фенестр. Дифференцировка каждого отдельно взятого скола, как правило, невозможна. В то же время есть ряд свидетельств того, что не все обнаруживаемые на репликах кавеолы были слиты с плазмалеммой в нефиксированном состоянии. В ряде случаев слияние везикул с плазмалеммой индуцируется глютаральдегидом [97]. Это во многом объясняет появление картин частичного слияния везикул. По-видимому, под влиянием раствора глютаральдегида шейка везикулы суживается. Однако недавно с использованием метода СЗ-ГТ-КО было продемонстрировано, что химическая фиксация практически не стимулирует слияния мембран. Отмечено также, что в большинстве клеток в большей или меньшей степени прослеживается определенная закономерность в распределении кавеол по плазмалемме [26, 117]. В гладкомышечных клетках (ГМК), фибробластах, быстрых мышечных волокнах они организованы в четкие линейные агрегаты, линейные структуры, а в эндотелии имеют гексагональную упаковку (см. ниже). Поскольку правильная упаковка частично дезорганизуется колхицином и полностью цитохалазином В, то есть все основания предполагать, что распределение везикул определяется ориентацией примем-бранных элементов цитоскелета [423].

С помощью метода СЗ-ГТ-КО обнаружено, что мембрана окаймленных везикул с цитоплазматической поверхности покрыта гексагональной клатриновой сетью [224]. Сеть состоит из фибрилл толщиной 7 нм. Ячейки имеют диаметр около 30 нм и в большинстве своем 6-угольную форму, хотя встречаются 5- и 7-угольные. Окаймление вокруг небольших везикул содержит 5- и 6-угольные ячейки в равной пропорции. Молекула клатрина имеет своеобразную форму (клатриновый тример), которая при упаковке образует сеть с 6-угольными ячейками. Клатриновые тримеры, агрегируя, образуют корзины. Предложена модель сборки клатриновых тримеров, учитывающая, что три отростка, исходящих из центра молекулы, согнуты в центре в одном направлении [225].

Прикрепленные везикулы (кавеолы) сейчас рассматриваются в качестве универсальных биохимических котлов с иммобилизированными ферментами, доступ субстратов к которым регулирует диафрагма везикул. Кроме того, кавеолы могут играть роль миниатюрного рецептора растяжения [399].

5.3. ЯДРО

С помощью метода ЗСТ выявлены основные суперструктуры хроматина в ядре (от нуклеосом до спиральных нитей) и их пространственная упаковка [313]. Структура мембран кариотеки во многом сходна с таковой цистерн цитоплазматической сети (ЦПС). Число ВМЧ на PF-поверхности скола как внутренней, так и наружной ядерной мембраны существенно больше данного параметра на EF-поверхности (Кр>1).

Через регулярные промежутки внутренняя и наружная ядерные мембраны сливаются, формируя ядерные поры. Комплекс ядерной поры может формироваться путем индукции слияния внутренней и наружной ядерных мембран, при этом образуется сложная структура, которая включает собственно пору в кариотеке и прилежащую плотную пластинку хроматина [320]. Основной структурой комплекса ядерной поры является плотное кольцо из восьми субъединиц, которое может открываться и закрываться. Главная роль плотных пластинок хроматина связана с распределением, стабильностью и, возможно, с биогенезом ядерных пор (табл. IX). Фиксация глютаральдегйдом приводит к сжатию открытых ядерных пор [544].

Число ядерных пор не зависит от общего количества ядерной ДНК, величины поверхности и объема ядра, числа геномов, но тесно связано с метаболической активностью ядерного аппарата ядра, транскрипционной активностью или выделением продуктов в цитоплазму. Число ядерных пор увеличивается с началом синтеза ДНК [32]. Вариации в распределении и количестве ядерных пор не связаны с дополнительным синтезом мембран [119].

В ходе митоза для быстрого образования пор во время реконструкции кариотеки необходимо сохранение частей порового комплекса у хромосом. Во время формирования ядерной мембраны в стадию телофазы митоза двухслойная кариотека прикрепляется к хроматину [320]. Считают, что рост ядерной мембраны возможен тремя способами: 1) включение предшествующих единиц (цистерн, везикул), 2) включение индивидуальных молекул, 3) слияние и развертывание липидных мицелл (мицеллярных агрегатов) [176].

5.4. МИТОХОНДРИИ, ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ СЕТЬ,

ПЛАСТИНЧАТЫЙ КОМПЛЕКС (ГОЛЬДЖИ)

При скалывании митохондрий различных клеток на репликах формируются во многом однотипные структуры (табл. VIII).

Выделяют три отличающихся по внутреннему строению типа митохондриальных мембран: наружная, внутренняя и мембраны крист [476, 477]. На PF-пoверхности скола наружной мембраны плотность ВМЧ низкая [131]. ВМЧ часто образуют ряды, формирующие сеть [477]. Ряды ограничивают участки мембраны, лишенные ВМЧ. Диаметр ВМЧ варьирует от 12 до 24 нм, по внешнему виду они иногда напоминают чешуйки. На EF-поверхности содержание ВМЧ меньше. Наружная мембрана митохондрий образует контакты как с другими митохондриями, так и с плазмалеммой. Плазмалеммо-митохондриальные контакты, обнаруженные в жировой ткани, характеризуются наличием скоплений ВМЧ на PF-поверхности скола мембран митохондрий [504]. В местах межмитохондриальных контактов кардиомиоцитов крыс наблюдается максимальное сближение внешних мембран соседних митохондрий, а также скопление и особая упаковка на их поверхностях частиц размером порядка 10-12 нм [3]. ВМЧ иногда формируют ряды, дающие на сколах гребни и канавки [156]. Внутренняя митохондриальная мембрана отличается значительно большим содержанием ВМЧ на сколах. На PF-поверхности встречаются крупные (до 24 нм в диаметре) частицы. Как правило, ВМЧ образуют плотно упакованный монослой, который на сколах дает характерную шероховатую поверхность [476]. Внутренняя мембрана образует круглые впячивания (на сколах имеют вид углублений с ровным дном), связывающие ее с мембранами крист [131].

Из-за частого перехода плоскости скола с наружной митохондриальной мембраны на внутреннюю на репликах может возникать своеобразная лоскутообразная структура. Было обнаружено, что частота перескакивания связана с функциональным состоянием митохондрии. В фосфорилирующих органеллах она выше, чем в свежеизолированных или энергезированных. Высказано предположение, что в области перескакивания внутренняя и наружная митохондриальные мембраны находятся в слившемся состоянии с образованием инвертированной мицеллы (НII-фаза). Эти участки, как полагают некоторые исследователи [527], вовлечены в импорт из цитоплазмы митохондриальных белков.

Распределение и размеры ВМЧ на мембранах крист отличаются от таковых на внутренней мембране. Среди чрезвычайно плотно упакованных частиц на поверхности скола встречаются палочковидные ВМЧ длиной от 12 до 50 нм (наиболее часто 12-20 нм). Преобладают глобулярные частицы диаметром 9-10 и 12-14 нм. Очертания некоторых ВМЧ имеют квадратную и даже треугольную форму. Плотная упаковка ВМЧ ведет к снижению текучести мембраны. Наличие большого количества интегральных белков, состоящих главным образом из ферментов цитохромоксидазной системы, отражает особую функциональную роль мембран крист митохондрий в энергообеспечении клеток. По мнению Шестранда и Кассела [476] , нет оснований утверждать, что кристы являются складками внутренней мембраны митохондрий. Они считают, что кристы соединяются с внутренней митохондриальной мембраной посредством нескольких стеблеобразных трубчатых сочленений.

В ряде клеток, имеющих митохондрии особой формы, например в надпочечниках, изучение и идентификация плоскости скола крист чрезвычайно затруднены.

На репликах гранулярная ЦПС может быть отдифференцирована от агранулярной только в том случае, если она формирует более или менее выраженный пакет цистерн. Кр мембран ЦПС значительно больше 1, например в саркоплазматическом ретикулюме он равен 9 [377]. В секретирующих эпителиальных клетках численная плотность ВМЧ на PF-поверхности бывает настолько велика, что реплика имеет шероховатый вид. Между мембранами цистерны ЦПС встречаются своеобразные поры, образующие каналы между соседними цистернами. Эти поры имеют важное значение для обеспечения связей между различными пространствами клетки и, кроме того, механически стабилизируют цистерны. Содержание холестерина в мембранах цитоплазматической сети невелико [370].

Мембраны пластинчатого комплекса (Гольджи) весьма гетерогенны по плотности ВМЧ на сколах. Например, на репликах инсулиноцитов формирующиеся цистерны содержат 3000 ВМЧ, зрелые - 800, а секреторные гранулы - лишь 250 ВМЧ на 1 мкм2. Как и в мембранах ЦПС, Кр мембран пластинчатого комплекса довольно высок. Различия в концентрации ВМЧ заметны не только между двумя цистернами, но и в пределах одной цистерны. Эти данные указывают на то, что количество интегральных белков меняется от наружного (формирующегося) к внутреннему (зрелому) полюсу комплекса. Причем их концентрация оказывается минимальной в мембранах секреторных гранул. В то же время количество холестерина, если судить по числу ФСД, возрастает [374].

5.5. ЦИТОСКЕЛЕТ


При использовании метода ЗС элементы цитоскелета выявляются плохо. Поперечный скол цитоплазматического матрикса обычно не несет на своей поверхности рельефных структур, отражающих наличие цитоскелетных образований. Изредка вблизи плазмалеммы встречаются небольшие столбики диаметром около 30 нм, отбрасывающие довольно длинные тени. Эти структуры представляют собой сколы микротрубочек, идущих в направлении, поперечном плоскости разлома (табл. VIII, д). Микротрубочки, параллельные этой плоскости, раскалываются вдоль длинной оси, что свидетельствует о том, что связывание между субъединицами микротрубочек слабое и смежные поверхности субъединиц имеют гидрофобную природу. Субъединицы располагаются с интервалом 8 нм [288]. Микрофиламенты различных классов и образуемые ими пучки обнажаются на поверхности скола лишь после травления. Однако, поскольку в условиях применения фиксаторов и криопротекторов глубинное травление затруднено, получаемая информация не несет существенной новизны.

Новый этап в изучении строения цитоскелетных структур клетки связан с именем Хьюзера 1223, 226], который разработал метод СЗ-ГТ-КО. В дальнейшем им и его сотрудниками был проведен подробный и углубленный анализ строения цитоскелета в большинстве клеток, имеющих специализированные образования на поверхности. Цикл этих работ начинался с исследования организации концевых элементов нервного синапса.

Много нового указанный метод дал для изучения структуры цитоплазматического матрикса. До сих пор в литературе [8] дебатируется вопрос о реальности существования описанной Портером [397] микротрабекулярной решетки. Основным возражением является возможность артефактного формироваия подобной структуры. Отрицание существования микротрабекулярной решетки основывалось и на данных, полученных с помощью СЗ-ГТ-КО. Было показано, что цитоплазма содержит сеть дискретных филаментов, заключенных (и часто затененных) в плотную гранулярную или умеренно филаментную субстанцию. В отличие от фиксированных и высушенных с помощью перехода через критическую точку препаратов, на образцах, полученных с помощью данной методики, обнаружены дискретные длинные микрофиламенты, вероятно представляющие собой главные элементы цитоскелета. Они связаны с дискретным гранулярным матриксом [432]. С помощью метода ЗТ показано, что осмиевые фиксаторы отлично сохраняют все детали строения клеточных мембран, включая гликокаликс, рибосомы и т. д. Однако после осмиевой фиксации значительно нарушалась структура всех цитоскелетных элементов, кроме промежуточных филаментов [259, 368].

Метод СЗ-ГТ-КО позволил уточнить строение дискретных фибриллярных структур цитоскелета. Например, в железистых клетках передней доли гипофиза выделено несколько видов микрофиламентов: 1) ассоциативные (диаметром 4-10 нм), которые отходят от сетей филаментов и заканчиваются на наружной поверхности мембран клеточных органоидов и внутренней поверхности плазмалеммы; 2) соединяющие (такого же размера), связывающие соседние органоиды, секреторные гранулы и плазмалемму; 3) связующие (диаметром 3-8 нм), которые под прямыми углами прикрепляются к мембранам кариолеммы, эндоплазматической сети, пластинчатого комплекса (Гольджи); подобные филаменты могут соединять соседние клетки. Указанные филаменты вместе с микротрубочками обеспечивают поддержание и изменение формы клеток и контролируют транспорт секреторных гранул [440].

Существенный интерес представляют результаты по исследованию цитоскелетных элементов специализированных структур клеточной поверхности, например микроворсинок щеточной каемки. Выделены две главные структуры: сердцевина микроворсинки, состоящая из пучков актиновых филаментов, и терминальная перепонка, образующая две зоны. Около zonula occludens расположены круговые пучки актиновых филаментов, связанные с цитоплазматической мембраной с помощью адгезивной пластинки. Пучки актиновых микрофиламентов из микроворсинок простираются в апикальную цитоплазму и переходят в корешки микроворсинок [346]. Ранее было показано, что на верхушках микроворсинок энтероцитов ВМЧ на PF-поверхности скола плазмалеммы отсутствуют, хотя здесь к плазмалемме прикрепляются микрофиламенты [513]. Это указывает на то, что ВМЧ не имеют отношения к прикреплению актиновых филаментов к плазмалемме.

В стереоцилиях рецепторных клеток внутреннего уха описан способ прикрепления актиновых филаментов к кутикулярной пластинке с помощью нитевидных филаментов, идущих от пучков актиновых филаментов к лимитирующей мембране. С другой стороны, апикальные концы актиновых филаментов как бы распадаются на метелки, ветви которых прикрепляются к плазмалемме, последняя в этих участках образует выступы или ниши [231]. В области расположения кутикулярной площадки прилежащие актиновые филаменты поперечно соединены друг с другом с помощью нитей диаметром 3 нм. Пучки актиновых филаментов в области zonula adherens формируют вокруг апикальной поверхности клетки петли. Обнаружены также немногочисленные актиновые филаменты, вытянутые параллельно контактным фибриллам ПК.

Цитоскелетные элементы ресничек устроены еще более сложно. Во внутреннем участке переходного отдела реснички отчетливо выявляются три типа пластинчатых структур. Терминальная пластинка содержит фибриллярные связующие структуры, которые подвешивают центральные пластины со стороны периферической пары микротрубочек. Два других типа пластин не связаны с подвешивающими структурами. В верхней части переходного отдела реснички одна из центральных микротрубочек вдается глубже в пространство, окруженное кольцевой структурой. Центральный пузырек базального тельца также подвешен посредством тонких фибриллярных связующих структур со стороны периферических триплетов. Скопления частиц ожерелья на PS-поверхности мембраны отсутствуют. Описана структура в виде гребня, которая, очевидно, играет роль якорного образования для мембранных частиц и V-образных мостиков, отходящих от периферических дублетов микротрубочек [57].

Сопоставление упаковки элементов цитоскелета в подмембранном слое цитоплазмы клеток с распределением лектиновых рецепторов по ее поверхности и анализ взаимосвязи этих структур позволяют сделать заключение о существовании в клетках рецепторно-цитоскелетного комплекса [7]. Поэтому предположения о гликопротеиновой и гликолипидной природе внутримембранных частиц, а также о возможности их участия в осуществлении структурной связи параплазмалеммального слоя клеточной поверхности с его подмембранным (кортикальным) слоем представляются вполне вероятными. При этом, если внешний (параплазмалеммальный) слой гликопротеинов в основном ответствен за непосредственную связь клетки с окружающей средой, то внутренний (кортикальный), получающий через плазмалемму информацию с поверхности, координирует совместную работу мембраны и всего цитоскелета. Описано несколько способов взаимодействия элементов цитоскелета с плазматической мембраной:

непосредственное прохождение микрофиламентов через бислой липидов, связь микрофиламентов с интегральным белком, 3) связь с интегральным белком посредством вставочного минорного белка. Показано также, что с мембраной взаимодействуют также механохимические белки (актин, спектрин, минорные протеины и др.) [434].


## Глава 6 (

Глава написана в соавторстве с Е. С. Снигиревской.). МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОНТАКТЫ. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

В настоящее время в соответствии с ультраструктурными особенностями различают следующие типы специализированных контактов: 1) плотный контакт (ПК) -zonula occludens, occludding junction, tight junction, closing belt (его разновидность - фрагментарный плотный контакт, focal tight junction); 2) септированный контакт - septate junction, septate desmosome; 3) промежуточный контакт-zonula adherens, intermediate junction-belt desmosome (его разновидность в сердечной мышце - fascia-adherens); 4) десмосома - macula adherens, desmosome, spot desmosome (ее разновидность - полудесмо-сома, hemidesmosoma); 5) щелевой контакт (ЩК) -gap junction.

С функциональной точки зрения, можно выделить следующие типы межклеточных контактов [490]: 1) контакты, которые вместе со специализированными насосами обеспечивают создание и поддержание осмотических градиентов между двумя сторонами клеточного пласта (морфологически этому типу соответствует ПК); 2) контакты, через которые реализуется обмен между смежными клетками ионами и низкомолекулярными соединениями (ультраструктурно это ЩК); 3) контакты, образующие прочное механическое соединение между клетками, а также между ними и неклеточными компонентами ткани (структурно это десмосомы, промежуточный контакт и т. п.); 4) контакты, обеспечивающие стабильность и минимальность величины межклеточной щели для свободного прохождения растворов и создании определенной механической прочности (морфологический аналог - септированный контакт); 5) соединения, позволяющие осуществлять однонаправленную передачу потенциалов действия от одной клетки к другой (структурный эквивалент - электрические синапсы).

Комплекс трех контактов - плотный, промежуточный, десмосома - встречается почти во всех эпителиальных тканях позвоночных животных. Располагаясь в названном порядке от апикальной части клетки к базальной, они соответствуют описанному методом световой микроскопии терминальному замку (terminal bar).

Ведущим методом изучения структуры специализированных контактов в настоящее время является метод ЗСТ, который позволяет анализировать их трехмерную архитектонику, оценивать проницаемость.

При структурном анализе специализированных клеточных контактов не следует ограничиваться лишь одним методом, так как только комплексный подход позволяет получить полную информацию об их структуре. В частности, для корректного морфологического анализа ПК (табл. X и XI) и ЩК (табл. XII) необходимо пользоваться по крайней мере методами ультратонких срезов и ЗС. При этом типичная картина, выявляемая на ультратонких срезах, не всегда подтверждается при их анализе методом ЗС. С другой стороны, морфологический анализ контактов желательно подкреплять функциональными исследованиями.

Представленные в настоящей главе результаты по структуре специализированных межклеточных контактов тканей животных базируются главным образом на использовании метода ЗС. Вместе с тем для демонстрации функциональных аспектов тех или иных структур привлечены данные, полученные с применением других методов анализа. Учитывая все увеличивающийся интерес исследователей к этой проблеме и соответственно нарастающий с каждым днем поток публикаций, настоящая сводка является далеко не полной. Она включает в себя лишь наиболее существенные литературные и некоторые собственные данные.

6.1 ПЛОТНЫЙ КОНТАКТ

ПК описаны в эпителиальных и нервных тканях позвоночных животных. Ему приписывается участие в адгезии между клетками, а также в создании барьера для диффузии веществ по межклеточному пространству. По мнению ряда авторов [4, 28, 35], этот контакт, не являясь абсолютно непроницаемым для воды и ионов, участвует в регуляции водных и ионных потоков через эпителиальные слои. Существуют данные о том, что ПК представляют собой барьер для латеральной диффузии мембранного холестерина [333]. В экспериментах с культурой эпителиальных клеток, зараженных вирусом, было показано, что ПК эпителиев препятствуют перемешиванию компонентов двух мембранных доменов, апикального и базолатерального, различающихся своим химическим составом [524]. Вместе с тем опыты с мечеными фосфолипидами показали, что ПК ограничивают латеральное движение липидов только в наружном монослое плазмалеммы [525].

ПК появляются в эмбриональном развитии позвоночных уже на стадии бластулы и в значительной степени определяют морфогенетические процессы, создавая в развивающемся органе осмотический градиент; они непосредственно участвуют в митотическом делении. Большое значение придается ПК в нервных тканях. Они встречаются в миелиновой оболочке как центральной, так и периферической нервной системы и, по предположению ряда исследователей [434], возможно, определяют проводящие свойства мякотных нервных волокон. На основании того факта, что ПК появляются на ранних стадиях миелинизации, было сделано заключение, что они участвуют также и в этом процессе.

Особую роль ПК играют в эпителии половых желез, обеспечивая барьер между спермием и иммунологически компетентными клетками. Это предотвращает аутоиммунную реакцию в мужском организме, а следовательно, и стерилизацию. Эта функция ПК способствует выживанию видов [182].

ПК имеют строго определенную локализацию в ткани. Они располагаются в виде сплошного пояса в апикальной части клеток, отделяя межклеточное пространство органа от его полости. В редких случаях, например в предстательной железе, ПК обнаружены в базальной части клетки и даже между отростками одной клетки [257]. В месте расположения ПК наружные осмиофильные слои плазматических мембран сливаются и даже исчезают (по данным ультратонких срезов, см. обзор [35]).

В высоковольтном электронном микроскопе в области ПК выявляются тонкие (7 нм) филаменты, связанные в основном с участками слияния мембран [235]. Предполагается, что эти актиноподобные филаменты участвуют в сохранности и регуляции ПК (ультратонкая картина ПК достаточно подробно описана в литературе; см., например, [6, 35]). Дополнительные сведения о структуре и свойствах ПК можно получить с помощью электронно-плотных меток, для которых он, как правило, непроницаем. Это показано для гемоглобина, пероксидазы хрена, рутения красного, альцианового синего, лантана и др. [17, 35, 36].

Для демонстрации барьерных свойств ПК и его перестроек широкое применение получили соли лантана. При перфузии печени крысы 0.3%-ным раствором LaCh метка выявляется в кровеносных сосудах (синусоидах) и в межклеточном пространстве печени, но никогда не встречается в просвете желчного капилляра. Этот факт свидетельствует о том, что лантановая метка не проникает через ПК, отделяющие межклеточные щели между гепатоцитами от просветов желчных капилляров.

Большой вклад в изучение структуры ПК внес метод ЗСТ. На сколах ПК на PF-поверхности наряду с ВМЧ обнаруживаются ветвящиеся и анастомозирующие друг с другом гребни, направленные вдоль апикальной поверхности клетки. При круговом напылении видно, что они состоят из дискретных частиц. На EF-поверхности меньше ВМЧ и комплементарных гребням желобков. Обнаружение такой структуры говорит о существовании прочной связи между клетками и объясняет адгезивные и барьерные свойства этой области клеточных мембран. Считается, что эти гребни и желобки соответствуют наблюдаемым на ультратонких срезах пунктирным осмиофильным линиям слияния ПК [490] и отражают наличие здесь особых структур - контактных фибрилл (КФ) (табл. XIII, б и в; рис. 8).

В некоторых работах показано [490], что гребни лучше сохраняются на фиксированном глютаральдегидом материале, что может указывать на их протеиновую или липопротеиновую природу. Высказано предположение [523], что ПК состоят из протеиновых субъединиц, которые сшиваются глютаральдегидом. Кроме того, образуются связи между протеинами контакта и периферическими протеинами цитоплазматического слоя плазматической мембраны, что приводит к такой ориентации плоскости скола, при которой гребни оказываются на PF-поверхности. В нативном состоянии КФ ПК, по-видимому, состоят из отдельных белковых субъединиц, связанных с наружным монослоем липидов.

В месте соединения трех Клеток сеть КФ меняет свое строение. Она как бы вытягивается (расширяется) в базальном направлении с образованием характерной структуры. В центре такого тройного контакта располагаются три вертикальные фибриллы (по одной в плазмалемме каждой клетки), ВМЧ которых скрепляются друг с другом в виде своеобразной тройной застежки. С каждой стороны от центральной фибриллы по направлению к другой вертикальной полоске, расположенной несколько отступя, отходят короткие горизонтальные соединительные фибриллы. Вся структура напоминает двойную лестницу [490] (табл. X).

Физиологическими методами показано, что эпителиальные пласты разных органов отличаются по своей проницаемости. Различают эпителии с низкой и высокой трансэпителиальной проницаемостью (tight, leaky epithelia). Их свойства в значительной степени определяются структурой ПК- С помощью метода ЗСТ обнаружена корреляция между структурой ПК и проницаемостью эпителия [35]. Оказалось, что чем менее проницаем эпителиальный пласт для ионов, тем большее количество гребней присутствует на сколе ПК. Проницаемость ПК определяется также степенью непрерывности КФ. В эпителии дистального канальца почки мыши в ПК выявляется пять гребней, а в хорошо проницаемом эпителии проксимального канальца - лишь один [373]. Однако эта закономерность прослеживается не во всех эпителиях, и не всегда проницаемость ПК прямо коррелирует с их структурой, выявленной методом ЗС. Так, оказалось, что в высокопроницаемом эпителии сосудистой оболочки глаза имеются ПК, состоящие из большого количества гребней [522]. При исследовании реплик с комплементарных поверхностей скола этого эпителия обнаружена прерывистость гребней его ПК [522]. Вместе с тем в эпителии тонкого кишечника, обладающем меньшей проницаемостью, прерывистые гребни встречались значительно реже, поэтому предполагается, что высокая трансэпителиальная проводимость сосудистой оболочки глаза определяется прерывистостью гребней ПК. Эта точка зрения подтверждается некоторыми данными по изменению ПК в ходе развития организма [435].

Рис. 8. Модели строения ПК и их комбинаций с ЩК.

А и В- варианты прохождения скола и формирования теней (утолщения) после напыления металла (стрелка - направление напыления). А- модели: 1 - Чаркрофта-Булливанта, 2 - Симионеску, 3 - Стехелина, 4 и 5 - Булливанта, модифицированная Хирокавой (варианты перехода скола с одной поверхности на другую, прерывистая линия - истинное расположение гидрофобной поверхности липидного монослоя после его коллапса в вакууме при скалывании), 6 - ПК в венулах (прерывистая линия - ВМЧ. располагающиеся глубже, чем плоскость рисунка); Б - модель ПК, основывающаяся на представлениях о небелковом происхождении ВМЧ (в местах контактов биомембрап смежных клеток бислой липидов переходит в HII-фазу с образованием длинных гемимицелл, которые на сколе образуют характерные гребни и желобки, свойственные КФ); В - схема прохождения скола по ЩК, ассоциированному с ПК; Г - схемы формирования изображений при сколах фенестр и везикул с использованием КО: 1 и 4 - EF, 2 и 3 - PF, стрелки - направление напыления при последовательных (а-г) поворотах образца на 180°, под каждой схемой представлен график оптической плотности полученной реплики в плоскости рисунка.

Кроме того, известны ПК с более или менее крупными перерывами в гребнях (фрагментарный ПК), через которые способны проникать даже крупномолекулярные соединения. Такое строение описано для эндотелия капилляров, а также для пучковой зоны коркового вещества надпочечников. В последнем случае это, по-видимому, связано с необходимостью обеспечения свободного потока стероидных гормонов от паренхимных клеток в кровяное русло [6, 35].

Однако существует мнение [537], что качественная оценка целостности (непрерывности) КФ без анализа комплементарных реплик субъективна и не может прямо коррелировать с проницаемостью.

Таким образом, имеющиеся в литературе данные по степени прерывистости фибрилл ПК позволяют выделить три морфологических типа этой структуры: 1) непрерывный ПК, 2) ПК с отдельными прерывающимися гребнями, 3) фрагментарный ПК с крупными порами. Кроме того, на основании получаемых на сколах картин ПК могут быть классифицированы следующим образом: 1) очень плотные, 2) плотные, 3) умеренно плотные, 4) неплотные, 5) текучие. К первой группе следует отнести ПК, которые имеют более 12-15 не содержащих перерывов КФ, ко второй - соединения, где количество непрерывных КФ превышает 8 либо больше 12, но с отдельными перерывами; третью группу составляют ПК с числом фибрилл более 3-4 или больше 8, но с прерывистыми КФ. Неплотные ПК состоят из 1-3 КФ с редко вкрапленными перерывами в гребнях. Наконец, соединения пятой группы не образуют сплошного пояса и представлены отдельными фрагментарными гребнями либо дискретными редко расположенными ВМЧ. В некоторых случаях гребни и ВМЧ отсутствуют совсем и ПК представлены лишь возвышениями на PF-поверхности и слабо выраженными углублениями на EF-поверхности.

Кроме того, ПК могут быть классифицированы по форме сети, образуемой КФ, по степени анастамозирования полосок (выраженная, слабая, отсутствие). КФ бывают прямыми и извилистыми, строго и не строго параллельными, часто они сливаются и образуют двойные гребни. В сети фибрилл встречаются узкие треугольные, полигональные и даже округлые ячейки. Величина их, как правило, возрастает по направлению к базальной стороне пояса ПК, на которой могут встречаться слепые отроги КФ, с другой стороны пояс может иметь законченную структуру.

Исследования структуры и функции ПК указывают на то, что он может перестраиваться и структурно, и функционально не только в течение жизни организма, но и при патологических состояниях органа, а также при ряде экспериментальных воздействий. Дезорганизация ПК, выявляемая методом ЗС, обнаружена в печени при холецистите, при злокачественном перерождении клеток, при перевязке желчного протока и т. п. Продемонстрирована реорганизация ПК в энтероцитах при их делении. Имеется множество примеров полиморфизма ПК в эмбриональной ткани, при культивировании клеток вне организма и при многих других состояниях [35, 121, 484, 490, 508, 531].

Значительная лабильность ПК подтверждается также целым рядом экспериментальных фактов. Оказалось, что они могут раскрываться и становиться проницаемыми для низко- и высокомолекулярных соединений. Это показано при обработке тканей бескальциевыми растворами, гипертоническими растворами мочевины, солей и сахарозы, дисахаридов и т. д. Обратимость этих изменений позволяет изучать не только процессы деградации этого типа контакта, но и его сборки [15, 17, 35, 326]. Действие на клетки бескальциевой культуральной среды, сбалансированной по остальным параметрам, приводит к изменению организации ПК и появлению прерывистых КФ. Причем процесс "открытия" ПК блокируется низкой температурой [315].

Результаты проведенных опытов указывают на большое значение в сохранности структуры и функциональной целостности ПК ионов кальция, а также поверхностных мембранных протеидов. Варьирование проницаемости ПК не всегда сопровождается изменениями их структуры, выявляемыми на репликах. В ряде случаев, однако, гипертонические растворы (сахара и мочевины), меняющие проницаемость ПК, существенно изменяют и его структуру - КФ фрагметируются, а в межфибриллярных полях появляется множество дискретных ВМЧ [18, 35, 89] .

Можно думать, что структурные перестройки специализированных межклеточных контактов связаны с нарушением регуляции подвижности компонентов плазматических мембран. Как предполагается в настоящее время, структура межклеточных контактов, в частности ПК, стабилизируется тонкими актиноподобными филаментами, локализованными во внутреннем примембранном слое. Имеются также сведения о непосредственной связи мембран в зоне ПК с микротрубочками. Более или менее жесткая структура ПК способствует ограничению латеральной диффузии структурных компонентов мембраны [235, 434].

Воздействие ряда агентов на плазматические мембраны вызывает нарушение этих взаимоотношений, в результате чего происходит перестройка структуры контактов. В отношении лантана на это указывают косвенные данные по действию этого иона на структуру плазматической мембраны. Лантан вызывает перераспределение ВМЧ, т. е. влияет на подвижность элементов мембраны. Этими данными можно, по-видимому, объяснить перестройку ПК в ЩК в культуре L-клеток, обработанной лантаном [35, 36].

Переход одних контактов в другие описан и при трипсинизации клеток культуры человеческой аденокарциномы [396]. Вместо имеющих место в норме десмосом появляются ПК и ЩК- Предполагается, что трипсинизация вызывает увеличение подвижности внутримембранных компонентов и латеральной диффузии и приводит к организации новых типов контактов из предшествующих структур.

Имеющиеся в настоящее время данные по морфологии ПК легли в основу гипотетических моделей его организации (рис. 8). Первой была предложена двухфибриллярная модель строения ПК [124]. Согласно этой модели, плазмалеммальные фибриллы, образуемые последовательно соединенными рядами ВМЧ, присутствуют внутри каждой противостоящей плазмалеммы и плотно соединены друг с другом. Считается, что скол может огибать ВМЧ только в пределах одной мембраны и не может направляться в смежную плазмалемму с формированием на одной плоскости разлома двойной КФ.

При анализе поверхностей сколотых мембран в области ПК фиксированных клеток мочевого и желчного пузыря был сделан вывод о том, что в области контакта имеется один набор фибрилл, пронизывающих обе контактирующие мембраны [535]. Такая структура ПК обеспечивает прочную связь между клетками и хорошо объясняет барьерные и адгезивные свойства этой зоны межклеточной границы. Разработка этой модели базировалась на следующих наблюдениях: 1) выявлялась значительная высота гребней, сравнимая с высотой ступеньки перехода скола с одной клетки на другую; 2) наряду с крупными гребнями на PF-поверхности, встречались небольшие гребни и на EF-поверхности.

Эксперименты, проведенные на модельных системах, показали, что смешивание бислойных липидов с липидами гексагональной фазы приводит первоначально к образованию липидных частичек, которые затем линейно выстраиваются, сливаются и формируют гребни, напоминающие гребни плотных соединений. Согласно одной из гипотез [138], липидные частички отражают присутствие инвертированных везикулярных мицелл, слияние которых приводит к образованию инвертированного цилиндра в гексагональной фазе липидов, соответствующего выявляемому на репликах гребню. Эта гипотеза укладывается в однофибриллярную модель строения ПК [536]. При этом фибрилла, или контактная полоска, соответствует инвертированному липидному цилиндру.

По мнению Стахэлина [489], в контактной полоске имеются два набора плазмалеммальных фибрилл, причем они состоят из протеиновых или липопротеиновых субъединиц. Соединяясь в межклеточном пространстве, субъединицы образуют связи, обеспечивающие сохранность ПК. Модель Стахэлина базировалась как на изучении фиксированных, так и на анализе нефиксированных энтероцитов тонкой кишки. Скол может проходить между частицами, а также с любой стороны от каждой фибриллы. Это обусловливает возможность возникновения гребней половинной высоты. В литературе в дальнейшем появились еще более убедительные доказательства в пользу двухфибриллярной модели. Булливанту [107] удалось получить комплементарные сколы плазматических мембран в области ПК с двумя наборами фибрилл. Было уточнено, что контакт между субъединицами соседних КФ осуществляется не по их вершинам, а по боковым поверхностям. Более того, Булливант предположил, что в процессе препаровки (ЗСТ) возникает сжатие липидных монослоев, что может существенно увеличивать высоту гребней. Его модель объясняет многие противоречия: вследствие коллапса липидов сквозь EF-поверхность после ГТ могут проступать КФ противостоящей мембраны.

Для решения вопроса о строении ПК был применен также метод малоуглового кругового напыления платины после ГТ [229]. Предварительно ПК расщеплялись между смежными клетками, т. е. противостоящие мембраны отделялись друг от друга. Такой подход позволил получить убедительные доказательства в пользу двухфибриллярной модели. Было показано, что на нефиксированном материале гребни преимущественно локализуются на EF-поверхности скола и являются прерывистыми, а канавки на PF-поверхности непрерывны. Изредка обрывки гребней встречались и на PF-поверхности. Из вышесказанного следует, что плазматические фибриллы в нативном состоянии непрерывны, однако пластические деформации, возникающие во время скалывания, делают их прерывистыми. Пара противолежащих плазмалеммальных фибрилл образует КФ.

При скалывании ПК может возникнуть несколько ситуаций, которые требуют адекватной терминологии. Поскольку в области FIK плазмалемма изогнута, то при сколе на PF-поверхности образуются гребни или возвышения, валики), а на EF - желобки (или углубления). На эту схему накладывается плоскость прохождения скола вокруг ВМЧ. Если ряд ВМЧ, формирующих плазматическую фибриллу, остается на PF-поверхности, то образуются гребни, на вершинах которых находятся более мелкие выступы. На EF-поверхности в этом случае образуются желобки, в середине которых проходят канавки (бороздки). Если ВМЧ сохраняются на EF-поверхности, то на реплике PF-поверхности видны гребни (возвышения, валики), по вершине которых проходят канавки (бороздки). В то же время препарат EF-поверхности характеризуется тем, что на дне желобков (углублений) проходят гребни. Конечно, степень прогнутости плазмалеммы различна. Поэтому валики и желобки не всегда четко идентифицируются.

Кроме того что возможны четыре варианта скола, надо еще учитывать, что ВМЧ, образующие плазматическую фибриллу, могут быть либо слившимися, либо иметь бусоподобный вид, причем между этими крайними возможностями существуют переходные формы. Более того, во время оттенения ширина канавки значительно уменьшается, а иногда ее вообще бывает трудно идентифицировать. На нефиксированном материале при раскалывании, как правило, образуются бусоподобные цепочки ВМЧ на EF-поверхности скола и непрерывные комплементарные канавки на PF.

При использовании метода СЗ-ГТ-КО также выявляются цепочки отдельных частиц на EF-поверхности и непрерывные канавки на PF [547]. Ряды частиц выявляются в связи с тем, что ВМЧ упакованы не столь плотно, а линия скола колеблется между двумя соседними клеточными мембранами.

ПК с равномерным распределением ВМЧ на PF- и EF-поверхностях описаны в различных эмбриональных эпителиях на начальных этапах образования ПК и в других быстро меняющихся тканях. Считается, что такое распределение ВМЧ соответствует незрелой форме ПК либо особому типу ПК, позволяющему клеткам относительно свободно двигаться [149] (рис. 9).

Рис. 9. Схема строения ПК, представлены возможные варианты скола,

Плазматические фибриллы на сколе выявляются в виде следующих образований: 1-3 - возвышения с редкими ВМЧ (1), с гребнем (2) и с желобком (3); 4-6 -углубления с редкими ВМЧ (4), с гребнем (в) и с желобком (6); 7 и 8 - две плазматические фибриллы смежных клеток образуют контактную фибриллу (7 - плазматическая фибрилла соседней клетки); 9 и 10 - образование рядов ВМЧ на нефиксированном образце.??


Было отмечено также, что в ряде случаев, например в венулах [464], количество КФ на репликах может быть больше числа пятен слияния на ультратонких срезах. В этом случае гребни и желобки, как правило, не содержат ВМЧ. Следовательно, гребни плазмалеммы в зоне ПК иногда могут рассматриваться как возможные, а не действительно существующие соединения. Строение ПК в аналогичных клеточных пластах, как правило, не имеет существенных видовых особенностей.

6.2. СЕПТИРОВАННЫЙ КОНТАКТ

Септированные контакты широко распространены в эпителиальных тканях беспозвоночных животных (см. обзор [35]). У позвоночных животных контакты септированного типа обнаружены лишь в тканях, секретирующих стероидные гормоны: в коре надпочечников крысы, интерстициальных клетках семенника [490] и клетках Сертали, а также в нервной системе [115, 133, 227] и желтом теле человека [400]. Кроме того, септированный контакт описан у простейших, находящихся на 2-клеточной стадии жизненного цикла, - в сизигии грегарины [34].

Относительно функции септированного контакта в литературе имеются различные мнения. Предположение о том, что септированный контакт является местом межклеточной связи [261], не нашло достаточного подтверждения. Наиболее широко распространена точка зрения, согласно которой он играет важную роль в межклеточной адгезии и в движении воды по межклеточному пространству (см. обзор [35]). Есть мнение [166], что септированные контакты клеток беспозвоночных функционально сходны с ПК тканей позвоночных животных и филогенетически являются их предшественниками. Поскольку между двумя особями сизигия грегарины отсутствует электрическая и диффузионная связь, нами был сделан вывод о том, что септированный контакт грегарины имеет лишь механическое значение, обеспечивая довольно прочную и гибкую связь между клетками [34, 35].

Изучение структуры септированных контактов различными методами электронной микроскопии выявило широкую вариабельность их структуры. На основании анализа результатов ряда работ [490] предлагается выделять три основных типа септированных контактов: 1) тип гидры (кишечнополостные), 2) непрерывный тип, или гладкий (насекомые, моллюски, ракообразные), 3) складчатый тип (большинство насекомых, черви). В 1979 г. Грин с соавторами [204] описал и у иглокожих еще один тип септированного контакта - анасто мозирующий, который является промежуточным между септированный контактом беспозвоночных и ПК позвоночных животных.

Контакты септированного типа значительно отличаются друг от друга на тангенциальных срезах и на репликах, получаемых методом ЗСТ. Вместе с тем они практически не отличимы на поперечных срезах, для них характерно наличие широкой межклеточной щели порядка 14 нм, перегороженной периодически повторяющимися, параллельными друг другу септами. Ионы лантана и рутениевого красного проникают в область септированных контактов и способствуют лучшему выявлению деталей их структуры [35, 490]. Поступление метки в область септированного контакта может быть связано с тем, что септы прерываются на разном уровне [166]. Этим, однако, нельзя объяснить проникновение красителей в область анастомозирующего контакта. По-видимому, более справедлива точка зрения [204], согласно которой проникновение лантана в межсептальные компартменты обусловлено проницаемостью для него самих септ. При обработке лантаном, добавленным в фиксатор, септы гладкого контакта выявляются в виде трехслойной структуры, состоящей из двух электронно-плотных периферических слоев и центрального электронно-прозрачного слоя. На тангенциальных срезах различные типы септированных контактов выглядят по-разному. Контакты типа гидры и непрерывного типа представлены параллельно идущими ровными линиями, тогда как в контакте складчатого типа эти параллельные линии имеют волнообразный характер.

На картинах, получаемых методом ЗС, в области мембран септированного контакта выявляются ряды частиц с диаметром 8.5 нм на одной из скалываемых поверхностей и соответствующие им вдавления на другой. Оказалось, что названные типы септированных контактов отличаются друг от друга поведением при скалывании: в типе гидры внутримембранные частицы остаются на EF-поверхности, тогда как в остальных типах они обнаруживаются на PF. Кроме того, в контакте типа гидры расположение частиц менее правильное, чем в гладком и складчатом [166]. В гладком типе септированного контакта у насекомых на PF-поверхности после фиксации часто выявляются непрерывные гребни, а на EF соответствующие им желобки, что сходно с строением ПК, но в данном случае они никогда не анастомозируют друг с другом.

Анастомозирующий тип септированного контакта описан в эндотелии нескольких представителей иглокожих [204]. При импрегнации этих тканей лантаном, а также при использовании метода ЗС выявляется сеть непрерывных анастомозирующих друг с другом септ. На основании того факта, что лантан проникает внутрь компартментов, ограниченных септами, предполагается, что сами септы проницаемы для этого иона.

Предложено несколько моделей организации септированного контакта. В большинстве своем они в значительной степени спекулятивны и основаны на противоречивых данных, поэтому здесь не рассматриваются. Наиболее четкие сведения имеются в литературе лишь по структуре септированного контакта гладкого типа (рис. 10). В гладком типе септированного контакта септы, располагающиеся над рядами внутримембранных частиц, соединяют мембраны контактирующих клеток. Так же как и в ПК, в септированном существует непрерывность между гидрофобными областями мембран соседних клеток.

Контакты, сходные по ряду структурных характеристик с септированным, описаны в некоторых органах позвоночных животных. Существует ряд данных, говорящих о том, что они относятся к совершенно другой функциональной группе контактов. В этом разделе они рассматриваются лишь в связи с внешним сходством этих структур с истинными септированными контактами при их изучении на ультратонких срезах. Примером таких контактов могут служить контакты между клетками коры надпочечников, секретирующими стероидные гормоны. Следует, однако, отметить, что на поперечных срезах этих контактов в межклеточной щели выявляются не типичные септы, а частицы размером 10-15 нм, которые способствуют сохранению ширины щели, обеспечивая свободное течение секреторных продуктов в кровь. Аналогичный тип контакта встречается и в нервной системе позвоночных между аксолеммой и прилегающими к ней мембранами миелиновой оболочки в области перехвата Ранвье [434]. Септированные контакты этих тканей проницаемы для ионов лантана и частиц микропероксидазы. В английской литературе эти типы контактов в ряде случаев обозначают как septatelike junctions.

Рис. 10. Схема организации септированного контакта гладкого типа.

Данные о локализации ВМЧ на PF и соответствующих им вдавлений на EF получены ЗС. Расположение септ и их взаимоотношения с мембранами контакта основаны главным образом на данных, полученных методом ультратонких срезов. Пояснения см. в тексте.

6.3. ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ КОНТАКТ

Промежуточный контакт описан в эпителиальных и железистых тканях беспозвоночных и позвоночных животных в непосредственной близости к ПК, а также в культуре эпителиальных клеток, опухолевых клеток, сердечных миобластов и др. (см. обзор [35]) (табл. X, а и XI, а).

Основной функцией промежуточного контакта, по современным представлениям, является его участие в межклеточной адгезии и в сохранности целостности органов при их механическом растяжении. Кроме того, ему приписывается важная роль в направленном морфогенезе в процессе развития тканей и клеточной дифференцировки. На основании того факта, что промежуточный контакт обнаруживается первым при реагрегации клеток губки после их дезинтеграции, делается вывод о том, что эта область клеточной мембраны играет важную роль в процессе узнавания клеток [448].

В эпителиальных и железистых тканях промежуточный контакт окружает клетку в виде сплошного пояса (zonula adherens), в отличие от сердечной мышцы, где он располагается лишь на поперечных границах мышечных клеток в области вставочной пластины, наряду со ЩК и десмосомами (fascia adherens). В миобластах клеточной культуры промежуточный контакт формируется на поперечных границах клеток, а также в инвагинациях плазматической мембраны свободных поверхностей [265].

Межклеточное пространство в области промежуточного контакта (шириной 15-20 нм) содержит тонкофибриллярный материал, выявляющийся в виде поперечных мостиков при использовании рутения красного. Мембраны в области контакта идут строго параллельно друг другу и обладают различной плотностью - экстрацеллюлярный слой выглядит менее электронно-плотным, чем цитоплазматический. К мембранам промежуточного контакта со стороны цитоплазмы примыкают зоны повышенной плотности. Эти уплотнения состоят из пучков тонких (7 нм) филаментов. Филаменты аналогичного диаметра пронизывают межклеточную область контакта [235, 421].

К уплотнениям промежуточного контакта всасывающих клеток кишечника подходят микрофиламенты терминального сплетения. На выделенной щеточной кайме этих клеток, используя метод декорирования фибрилл уплотненных зон тяжелым меромиозином, Роудвальд с соавторами [421] показал актиновую природу филаментов (с толщиной 7 нм). По предположению этих авторов, актиноподобные филаменты промежуточного контакта взаимодействуют с миозиновыми филаментами терминального сплетения, в результате чего происходит сокращение микроворсинок эпителиальных клеток. Большое значение для жизнедеятельности ткани имеет организация актиноподобных филаментов промежуточного контакта в форме сплошного пояса. Такая конструкция обеспечивает сокращение клетки по окружности и помогает сохранить целостность эпителиального слоя при слущивании отдельных клеток [235].

Промежуточный контакт сердечной мышцы, как уже упоминалось, прерывистый и имеет форму ленты, простирающейся вдоль поперечной границы клеток. В литературе проводится аналогия между этим типом контакта и Z-диском поперечнополосатой мышцы [267]. В сердечной мышце зоны промежуточного контакта являются местами включения актиновых филаментов толщиной 7 нм в плазматические мембраны. Показано, что актиновые филаменты соседних клеток соединяются друг с другом, образуя петли в области промежуточного контакта.

На репликах, получаемых методом ЗС, область промежуточного контакта характеризуется сравнительной бедностью ВМЧ на PF-поверхности [380, 490]. Других существенных особенностей этого контакта, выявляемых на сколах, не обнаружено. Обычно область промежуточного контакта располагается на сколах непосредственно за ПК, который хорошо идентифицируется.

6.4. ДЕСМОСОМЫ

Десмосомы описаны практически во всех тканях беспозвоночных и позвоночных животных. Они выявляются на самых ранних стадиях эмбриогенеза. Их количество широко варьирует в разных тканях и органах. В тканях, приспособленных к большим механическим нагрузкам (эпидермис кожи, шейка матки, сердечная мышца), обнаруживается большое количество десмосом [490] в то время как в нервной ткани их мало и структура их атипична. В некоторых тканях обнаружены полудесмосомы, например в ороговевающем эпидермисе кожи, в клетках эпителия, находящихся в контакте с основным веществом соединительной ткани, в тканевых культурах в области их контакта с субстратом, в области контакта паразитических клеток с тканями хозяина, в некоторых раковых клетках и др.

По современным представлениям, основной функцией этих контактов является их участие в межклеточной адгезии. К настоящему времени накоплено довольно большое количество данных, подтверждающих это положение. Обнаружена корреляция между степенью адгезии клеток и временем появления десмосом в развивающемся зародыше. Кроме того, как уже упоминалось, ткани, подвергающиеся механическим нагрузкам, обладают большим числом десмосом. В то же время при потере клетками адгезивных свойств количество десмосом снижается, например при обработке ткани бескальциевыми растворами, в результате которой вымывается адгезивный фактор. Отсутствие десмосом описано при кожных заболеваниях, сопровождающихся слущиванием кожи, а также при некоторых опухолях. Однако никакой строгой корреляции между количеством десмосом и опухолеобразованием не обнаружено [18, 35, 348, 490].

В эпителиальных тканях, обладающих соединительным комплексом, десмосомы располагаются ближе к базальной части клеток. В отличие от ПК и промежуточных контактов десмосомы - не непрерывные структуры, опоясывающие клетку целиком, а прерывистые, соединяющие клетки наподобие кнопок. Межклеточное пространство в области десмосомы относительно широкое (порядка 25 нм), мембраны идут параллельно друг другу. В центре десмосомы располагается электронно-плотный центральный диск, хорошо окрашивающийся рутением красным, что может указывать на большое содержание в нем кислых мукополисахаридов. В состав десмосом входят также цитоплазматические компоненты: пластины прикрепления и тонофиламенты. Пластины прикрепления (толщина около 15 нм) располагаются параллельно плазматическим мембранам. В литературе имеются противоречивые сведения о наличии электронно-прозрачного промежутка между пластинами прикрепления и цитоплазматической поверхностью десмосомальной мембраны. В большинстве старых работ, как правило, такая щель обнаруживалась [490]. Однако более углубленный анализ показал ее отсутствие [235]. После обработки срезов протеазой пластины прикрепления исчезают, тогда как центральный диск сохраняется, это подтверждает приведенные выше данные о содержании в нем мукополисахаридов. Результаты опытов по перевариванию десмосом пепсином и хемотрипсином указывают на то, что пластины прикрепления содержат большое количество ароматических аминокислот. Учитывая результаты по белковому составу пластин прикрепления и последние данные по отсутствию щели между ними и мембранами, можно думать, что они являются интегральной частью десмосомальной мембраны [35].

Со стороны цитоплазмы к пластинам прикрепления подходят пучки тонофиламентов! Они проходят через мембраны соседних клеток, делают петлю в области центрального диска и возвращаются в ту же клетку, способствуя их прочному сцеплению. При изучении структуры десмосом в высоковольтном микроскопе, а также при фиксации ткани в присутствии танина показано, что, наряду с тонофиламентами толщиной 10 нм, в их состав входят филаменты толщиной 7 нм [235, 266, 490], причем последние встречаются как в цитоплазматической области контакта, так и в межклеточной.

Для полудесмосом характерно асимметричное строение как в случае контакта клеток со стромой, так и между клетками некоторых опухолей. Пластина прикрепления встречается лишь в одной клетке, центральный диск выражен очень слабо [35].

На репликах область десмосомы выглядит как пятно неправильной формы, отличающееся от остальной части сколотой мембраны наличием плотнее упакованных ВМЧ со средним диаметром 8-10 нм; последние менее округлы и неоднородны по размерам по сравнению с ВМЧ окружающих областей.

По данным Пика с соавторами [380], размеры ВМЧ десмосом нефронов змеи, располагающихся на EF-поверхности, равны 12-14 нм. На PF-поверхности ими не обнаружено никаких комплементарных структур. В большинстве эпителиев ВМЧ встречаются на PF- и на EF-поверхностях [35, 235, 490]. На нефиксированных тканях на поперечных сколах видны обильные профили тонких микрофиламентов, которые пронизывают внутренний листок мембран, достигая наружный слой. Показано также наличие филаментов, пронизывающих десмосомальные мембраны, и филаментов, связывающих мембраны соседних клеток в области десмосомы.

В нефиксированных тканях десмосомные пятна чаще наблюдаются на EF-поверхности, а при их фиксации альдегидами частицы чаще выявляются на PF [4, 35, 490]. Филаменты прикрепляются к мелким гранулам, которыми, как предполагается, представлен на сколах центральный диск. Кроме того, вблизи цитоплазматической стороны контактной мембраны методом ЗСТ обнаружены филаменты толщиной 7 и 3 нм. Интересно, что структур, которые можно было бы идентифицировать как пластины прикрепления, не обнаружено. Вместе с тем при использовании метода ультратонких срезов картина обратная: хорошо выявляются пластины прикрепления и практически не выявляются в этой области фибриллярные структуры. Такую ситуацию можно объяснить тем, что плотный материал пластин прикрепления, пронизанный фибриллярными структурами, сильно гидратирован и только в случае использования метода ЗСТ, при котором происходит сублимация воды, фибриллы хорошо выявляются. По мнению Лелоупа с соавторами [298], эти филаменты толщиной 3 нм, выявляющиеся в примембранной цитоплазматической области контакта, представляют собой протофиламенты тонофиламентов, наличие которых вокруг полого стержня тонофиламента показано как в вышецитируемой работе, так и на выделенных десмосомальных фракциях методом ультратонких срезов [153]. Модифицированная схема строения десмосомы представлела на рис. 11 [298].

Рис. 11. Схема организации десмосомы.

1 - крупные удлиненные десмосомальные ВМЧ диаметром 12-20 нм; 2 - ВМЧ центрального диска диаметром 5 нм; ВМЧ выявляются как на EF, так и на PF десмосомальных мембран; 3 - протофиламенты диаметром 3 нм в пределах межклеточного пространства; 4 - филаменты диаметром 7 нм в области диска прикрепления (5); 6 - тонофиламенты диаметром 10-13 нм, расщепляющиеся на протофиламенты в диске прикрепления (5); прерывистые линии - гипотетические связи между филаментами различной толщины. Направление филаментов изображено в значительной степени произвольно в связи с противоречивостью литературных данных.

Структура полудесмосом, выявляемая методом ЗС, отличается от структуры десмосом. В области полудесмосом обнаруживаются скопления больших ВМЧ (с диаметром 20-30 нм). На нефиксированном материале видны филаменты, связывающие пластину прикрепления с плазматической мембраной [35].

Биохимический анализ фракций десмосом продемонстрировал значительную гетерогенность их липидного и белкового составов. Выявлен ряд мембранных протеинов и гликопротеинов, содержащих много сиаловых кислот. В состав липидов входят в больших количествах холестерин, сфингомиелин и ганглиозиды [153]. Белки тонофиламентов состоят из пяти полипептидных цепей, четыре из которых по электрофоретической подвижности совпадают с полипептидами прокератина.

В литературе существует много морфологических сведений о формировании и деградации десмосом в процессе развития организма [4, 35, 490]. Есть данные, заставляющие думать о том, что в процессе формирования десмосом участвует пластинчатый комплекс (Гольджи).

6.5. ЩЕЛЕВОЙ КОНТАКТ

Для обозначения ЩК предложено большое число терминов: nexus, close junction, macula (fascia) occludens, gap junction, macula close junction, small subunit gap junction, macula communicans. Последний термин - сообщающийся контакт - отражает функциональную роль ЩК [464]. При дальнейшем изложении мы будем придерживаться традиционной устоявшейся терминологии. Следует сразу оговориться, что термин "щелевые" отражает функцию межклеточной проницаемости (транспорт веществ из одной клетки в другую), а не проницаемости клеточного пласта. ЩК встречается во многих зрелых и эмбриональных тканях беспозвоночных и позвоночных животных, а также между клетками культуры ткани. ЩК, по современным представлениям, играют определяющую роль в межклеточных коммуникациях. Через эти структуры осуществляется межклеточный обмен ионами и метаболитами. Функциональные аспекты работы ЩК изложены в ряде обзоров и монографий [4, 35, 294, 382 , 411, 490].

Первые данные, указывающие на существование прямой связи между соседними клетками, были получены в опытах по измерению электрического сопротивления между соседними клетками и по перетеканию между ними флюоресцентной метки. Участки, обусловливающие низкое электрическое сопротивление между двумя соседними клетками, в физиологической литературе принято называть высокопроницаемыми контактными мембранами. После ультраструктурной идентификации этих специфических областей клеточных поверхностей они были названы ЩК- В последующие годы синтезированы флюоресцентные метки различной молекулярной массы, позволяющие оценить пористость областей ЩК. На основании исследований по перетеканию этих меток через ЩК было показано, что вещества с молекулярными массами до 380 проходят достаточно быстро. Диаметр пор, рассчитанный по данным цитируемых авторов, составляет 1.0-1.4 нм.

Предполагается, что через ЩК проникают и некоторые клеточные индукторы, в частности цАМФ, что особенно важно для нормального протекания морфогенетических процессов. Высказано мнение, что контактный перенос веществ играет определенную роль в регуляции роста клеток [35, 490]. Показано, что количество ЩК коррелирует с интенсивностью пролиферативной активности [487]. Кроме того, есть мнение [450], что ЩК эмбриона выполняют гомеостатическую функцию, принимая участие в регуляции и поддержании ионного и метаболического гомеостаза внутренней среды развивающегося организма, лишенного кровеносной системы.

Большое значение придается высокопроницаемым контактам при изучении процессов, обусловливающих малигнизацию тканей. Ранее была широко распространена точка зрения, согласно которой отсутствие связи между клетками - обязательный признак опухолевого роста [302]. Однако затем было показано, что рост одних опухолей сопровождается нарушением связи между клетками, а других- нет [4, 35, 123]. В тех случаях, когда имеет место электрическое разобщение клеток и уменьшение адгезивности, наблюдаются и аномалии в структуре их ЩК. Высказываются предположения о том, что эти аномалии вторичны и определяются перестройками плазматических мембран, возникающими при раковом перерождении, а дефекты в структуре и функции ЩК имеют генетическую основу (ЩК часто находят в развивающихся тканях и в опухолях [179]).

Обнаружена определенная зависимость между дефектами в развитии высокопроницаемых контактов и неконтролируемым ростом клеток. Опытами на клеточных культурах показано, что дефекты в структуре ЩК опухолевых клеток могут быть исправлены при гибридизации их с нормальными клетками [60, 541]. Некоторые типы тканей не имеют ЩК - они не обнаружены между эндотелиальными клетками некоторых кровеносных капилляров и венул, между продольно расположенными ГМК кишечника собаки, подвздошной кишки и яйцеводов крысы. В клетках миометрия они периодически появляются и исчезают [294]. Образование ЩК может быть временным [441].

ЩК на ультратонких срезах выглядит как специализированная область межклеточной границы, в которой мембраны соседних клеток идут строго параллельно друг другу на расстоянии 2-3 нм. В некоторых случаях вдоль контакта наблюдаются уплотнения цитоплазмы [35]. В электрических синапсах в области цитоплазмы, прилежащей к ЩК, всегда имеется значительное количество мембранных пузырьков. В случае однонаправленных синапсов структура их асимметрична, так как пузырьки обнаруживаются лишь в пресинаптическом элементе. Предполагается [486], что в этих пузырьках локализуется несвязанный кальций, регулирующий проницаемость ЩК электрического синапса.

При фиксации ткани в присутствии ионов лантана в ЩК выявляется средний электронно-плотный слой толщиной 7-9 нм за счет проникновения лантана не только в щель шириной 2 нм, но и в наружные слои плазматических мембран. Имеющиеся в литературе данные указывают на специфическое связывание лантана наружными слоями мембран в области ЩК [35, 294, 490]. В ряде случаев при импрегнации ткани лантаном обнаруживается глобулярная структура среднего слоя ЩК. Аналогичные результаты получены и при использовании других электронно-плотных меток: рутения красного, таниновой кислоты, уранил ацетата [35, 294]. С помощью лантановой метки на тангенциальных срезах было обнаружено, что в области ЩК присутствуют глобулы, организованные в ряде случаев в гексагональную упаковку [490]. Размеры глобул и расстояние между их центрами - 8-9 нм. В центре глобулы выявляется электронно-плотная точка [412], которая интерпретируется как гидрофильный канал.

Благодаря разработанной методике выделения ЩК [199] их удалось изучить методом негативного контрастирования. Картины, полученные этим методом, подтверждают данные о глобулярной структуре ЩК и их гексагональной упаковке [294]. Так же как и с лантановой меткой, при негативном контрастировании в центре некоторых глобул наблюдается электронно-плотная точка диаметром 2-2.5 нм. Соответствие этих размеров с размерами молекул, переходящих из клетки в клетку, говорит в пользу предположения о том, что эта точка представляет собой гидрофильный канал, соединяющий контактирующие клетки. Показано, что катионные красители проникают в центральный канал глобулы [65]. С помощью метода негативного контрастирования доказано, что каждая глобула, по современной терминологии коннексон, состоит из шести субъединиц, располагающихся вокруг канала [552].

Наиболее полная информация о прижизненной структуре ЩК получена при использовании метода ЗСТ. Принято считать, что скол в области ЩК может проходить по каждой из составляющих его мембран, а также по центральной области контакта. Показано, что ЩК в клетках разных животных скалываются по-разному, отражая, по-видимому, их различное строение. Так, оказалось, что у позвоночных животных и у моллюсков на PF-поверхности появляются агрегаты глобул, а на EF соответствующие глобулам вдавления, а для членистоногих характерен инвертированный тип (тип В) ЩК, при скалывании которого частицы обнаруживаются на EF-поверхности, а углубления на PF [294, 490].

После протеолиза клеток сердца и печени глобулярный характер мембран ЩК исчезает или менее выражен. Это свидетельствует о протеиновой природе коннексонов.

Проверка комплементарности структур ЩК печени и сердца крыс показала хорошее соответствие между впадинами и частицами. Незначительные сдвиги обусловлены, по-видимому, пластическими деформациями [143]. Количество ВМЧ ЩК значительно варьирует (от 2-3 до 200), максимальная площадь ЩК достигает 40 мкм2 и занимает до 20% поверхности клетки. В секретирующих клетках площади ЩК пропорциональны секреторной активности, а в клетках зернистого слоя фолликулов яичника, желтого тела и в амелобластах ЩК увеличиваются по мере дифференцировки клеток [294]. Число ЩК, приходящееся на одну клетку, также значительно колеблется. Например, в зрачковом сфинктере морской свинки обнаружено 100 ЩК на одну ГМК [183].

Рис. 12. Схема ультраструктурной и молекулярной организации ЩК.

А : 1 - коннексоны, пронизывающие каждую из мембран контакта, прочно связанные между собой в области межклеточной щели и состоящие из шести протеиновых субъединиц, между которыми располагается гидрофильный канал; большая часть межклеточной щели заполнена белками коннексонов; при скалывании мембран ЩК коннексоны выявляются на PF, а на EF - соответствующие им углубления (гексагональная упаковка коннексонов, выявляемая в основном на выделенных фракциях ЩК. вероятно, не отражает нативного состояния). Б- схема организации коннексона при открытом (1а) и закрытом (16) состояниях центрального канала.

Форма ЩК может быть самой разнообразной. Описаны круглые, овальные, полигональные, шестиугольные, линейные ЩК, соединения в виде теннисной ракетки, ЩК с окнами, с удлиненными ВМЧ. Окна могут иметь регулярный характер расположения или превращаться в полосы. В пределах одного ЩК могут быть зоны с меньшей плотностью расположения коннексонов. Эти коннексоны могут отличаться по размерам и быть связаны с EF-поверхностью [294]. В остеобластах и в клетках ряда опухолей кожи и аденокарциномы надпочечника найдены кольцевые ЩК (см. обзор [4]). Описаны ЩК между отростками одной и той же клетки.

Из вышесказанного следует, что строгая периодичность и гексагональная или близкая к ней упаковка не всегда являются обязательным критерием для идентификации ЩК. Размеры ЩК могут, по-видимому, отражать его функциональные возможности. Коннексоны ЩК при их анализе методом ЗС имеют в ряде случаев гексагональную упаковку. На верхушке каждой глобулы выявляются углубления с диаметром порядка 2 нм (рис. 12). Эти наблюдения также говорят в пользу существования в центре коннексона гидрофильной поры. В некоторых клетках описаны ЩК, содержащие два типа глобул: мелкие с небольшими расстояниями между их центрами (8-9 нм) и более крупные глобулы (10-11 нм) с большим расстоянием между центрами (19-20 нм) [294, 490] (табл. XIII, а). При КО на PF-поверхности скола четче выявляется вариабельность размеров ВМЧ [286, 521 ] (табл. XII и XIII, а). Кроме указанных двух типов ЩК, где ВМЧ имеют гексагональную упаковку, выделен третий - скопления частиц с прямоугольной упаковкой и расстояниями между коннексонами 6-8 нм [490]. Часто большие ВМЧ располагаются по периферии участка, заполненного частицами меньшего размера.

Была обнаружена корреляция между структурными перестройками ЩК и изменениями степени электрической связи соседних участков гигантского аксона рака. При подавлении связи наблюдалась тенденция к уменьшению размеров всех компонентов ЩК: уменьшение общей ширины контакта, уменьшение щели, уплотнение упаковки субъединиц и некоторое уменьшение их диаметра. Аналогичные изменения ЩК иногда происходят при их выделении. Соответственно при их изучении методом негативного контрастирования этот факт следует учитывать [294, 382].

С помощью сочетания методов малоуглового рентгеноструктурного анализа, высокоразрешающей электронной микроскопии, оптической фильтрации электронно-микроскопических изображений и биохимического анализа выделенных фракций ЩК удалось построить трехмерную модель ЩК и локализовать в ней основные химические компоненты: белки, липиды, воду [122, 311]. В этих исследованиях были выявлены вариации в структуре ЩК. Так, в одной из исследованных фракций постоянная гексагональной решетки составляла 8.7 нм, в то время как в другой - 8.2 нм. Ширина щели между контактирующими мембранами во втором случае оказалась на 0.8 нм меньше, чем в первом. Эти результаты указывают на то, что основные конформационные изменения связаны с белками, располагающимися в щелевой области контакта.

В более поздних работах [332] высказывалось вполне обоснованное предположение, что различные морфологические состояния ЩК не всегда коррелируют с физиологическим состоянием клеток: иногда эффект уплотнения распределения коннексонов (формирование гексагональной решетки) обусловлен фиксацией глютаральдегидом.

Коннексоны, по данным рентгеноструктурного анализа, имеют простую ось симметрии VI порядка и соответственно представляют собой гексамеры, состоящие из шести белковых субъединиц. Эти данные согласуются как с электронно-микроскопическими наблюдениями, так и с результатами по определению молекулярной массы основного белка коннексонов - коннексина. Протеиновые субъединицы коннексона организованы таким образом, что в его центре образуется сквозной канал диаметром 2 нм. Коннексоны соседних мембран находятся в тесном контакте на уровне середины межклеточной щели. Относительный объем, занимаемый частью коннексона, пересекающей мембрану, значительно меньше тех частей коннексона, которые из нее выступают. Тот факт, что обнаруженные конформационные изменения белков коннексонов сосредоточены в основном в межклеточной области контакта, позволил высказать предположение, что регуляция проницаемости, осуществляемая изменением диаметра канала, происходит в этой области [311]. На основании изучения ЩК методом трехмерной реконструкции электронно-микроскопических изображений, математический аппарат которого по существу аналогичен аппарату, используемому в рентгеноструктурном анализе, удалось показать, что длинные оси субъединиц несколько наклонены к центральной оси коннексона, образуя таким образом элемент со спиральной структурой. Предполагается, что при изменении наклона субъединиц может меняться диаметр канала и соответственно регулироваться проницаемость ЩК [518]. Сравнительно недавно процесс открывания и закрывания каналов коннексона промоделирован на компьютере [146].

Существует ряд работ [297, 461], в которых производился анализ белкового и липидного состава ЩК. Молекулярная масса основного белка ЩК, коннексина, оказалась равной приблизительно 26000. Кроме этого белка обнаруживается ряд минорных компонентов и продуктов их полимеризации. Основные фосфолипиды ЩК: фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. Нейтральная фракция липидов содержит в основном холестерин. ЩК разных тканей нередко имеют общие антигенные детерминанты [517], причем антитела к белкам ЩК блокируют их проводимость [222].

На рис. 12 суммированы основные результаты имеющихся в литературе данных по ультраструктурной и молекулярной организации ЩК, полученных методами электронной микроскопии, рентгеноструктурного анализа, оптической дифракции электронно-микроскопических изображений и биохимического анализа.

Существует широкий спектр факторов, вызывающих разобщение электрической связи клеток, сопровождающееся перестройками ЩK или их исчезновением. Проницаемость 1ПК регулируется концентрацией в цитоплазме несвязанного кальция [453]. Показано, что увеличение его концентрации способствует разобщению клеток [315]. ВМЧ ЩК при этом приобретают гексагональную упаковку. Сходную роль играют ионы водорода и вещества, разобщающие окисление и фосфорилирование. Под действием этих факторов ВМЧ ЩК могут образовывать ортогональную или ромбовидную упаковку [382].

С другой стороны, известны факторы, способствующие возникновению межклеточной связи. Так, опытами по дезагрегации и реагрегации клеток показано, что для формирования ЩК необходимым условием является присутствие в среде двухвалентных катионов: Са2+ и Mg2+ [449]. Агентом, усиливающим межклеточный обмен в несколько раз, оказались ионы лантана. Кратковременная обработка (10-15 мин) культур L-клеток 1•10-3 М лантаном приводит к увеличению степени связанности клеток в 2-3 раза. При этом не происходит каких-либо явных нарушений в структуре клеточных мембран, цитоплазмы и ядра. Вместе с тем ионы лантана модифицируют поверхностную мембрану L-клеток. Это выражается в уменьшении числа ПК и увеличении количества контактов щелевого типа, что коррелирует с усилением диффузионного обмена между клетками, определяемого по перетеканию флюоресцентного красителя [34].

Полученные данные о модифицирующей роли лантана следует учитывать при использовании этого иона для идентификации ЩК в электронном микроскопе, так как обработка этим агентом перед фиксацией может вызывать их изменения. При применении значительно больших концентраций лантана возможно даже слияние клеток по местам высокопроницаемых контактов [294].

Увеличение числа ЩК описано также при подавлении натриевой проводимости плазматических мембран мышечных клеток тетраэтиламмонием и 4-аминопиридином [260]. При этом мышцы оказываются механически более активными, что, в принципе, может обеспечиваться увеличением межклеточных связей. Расслоение ЩК с получением полуконтактов происходит при перфузии (например, печени) гипертоническими растворами дисахаридов. Моносахариды такого эффекта не давали, однако замещение ионов хлора на ионы пропионата приводило к расщеплению ЩК [198].

Интересно отметить, что возникновение ЩК при действии некоторых агентов показано на клетках, которые в нормальных условиях вообще не имеют ЩК. Так, при агрегации почвенных амеб в присутствии лизолицитина образуются ЩК [488].

Весьма существенные перестройки ЩК испытывают в ходе развития организмов. Как известно, морфогенез сопровождается изменением количества клеток и их расположения относительно друг друга. При этом неизбежны процессы деградации одних контактов и возникновения других. Имеется ряд работ, посвященных изучению процессов сборки ЩК в эмбриогенезе многоклеточных животных. В эмбриональных тканях, начиная с бластулы, отмечается большое количество мелких и лабильных ЩК, обеспечивающих электрическую связь между клетками. Затем в одних тканях взрослых животных количество ЩК уменьшается, тогда как в других ЩК, сливаясь друг с другом, укрупняются.

Аналогичные изменения ЩК претерпевают и при регенерации печени. В литературе имеются данные и о формировании ЩК уже в дифференцированных тканях, например при регенерации [35, 294, 382, 490]. Один из гипотетических механизмов формирования ЩК состоит в следующем [254]: когда мембраны двух клеток тесно подходят друг к другу (примерно на расстояние 10-20 нм), обращенные во внеклеточное пространство участки ВМЧ соседних мембран начинают каким-то образом взаимодействовать друг с другом, образуя сцепленные пары; перемещение ВМЧ по мембране происходит, по-видимому, за счет изменений субмембранных элементов (микротрубочек и микрофиламентов) [4, 194]. В то же время есть данные [93], свидетельствующие против цитоскелетного заякоривания образующихся пар коннексонов. Рост ЩК, по существующим данным [426], происходит путем слияния агрегатов коннексонов. Согласно другой гипотезе [93], мембранные белки, составляющие ЩК,агрегируют в области контакта и связываются попарно, при этом образующиеся диады пересекают межклеточное пространство в области контакта мембран соседних клеток. Остается открытым вопрос: что удерживает скопления больших количеств диад коннексонов в агрегированном состоянии? Выдвинуто предположение [93] о том, что агрегаты диад удерживаются не за счет притяжения между соседними диадами, а в результате минимизации сил отталкивания между контактирующими мембранами. Согласно предложенной модели, выход диады из агрегата увеличивает площадь энергетически невыгодного тесного контакта между мембранами соседних клеток, что создает движущие силы для возврата этой диады в агрегат [93].

Предполагается, что уменьшение числа ЩК в условиях эмбриогенеза и в зрелой ткани может осуществляться посредством их интернализации с помощью эндоцитоза. Вторым способом исчезновения ЩК является рассеивание составляющих их ВМЧ [294 , 551].

Перечисленные выше факты преобразований ЩК свидетельствуют о возможности функциональных изменений плазматических мембран, способствующих перемещению мембранных компонентов.


***


Как видно из представленного материала, накопленные к настоящему времени данные по ультраструктуре специализированных контактов внесли большой вклад в понимание механизмов межклеточных взаимодействий.

Так, обнаружена корреляция между структурой ПК и трансэпителиальной проницаемостью, между структурой ЩК. и степенью электрической связи клеток. Контакты, имеющие наибольшее значение для адгезии между клетками (промежуточный, десмосома), имеют очень сложную структуру, способствующую наиболее прочному и гибкому сцеплению клеток.

Каждый из перечисленных типов межклеточных контактов занимает в ткани вполне определенное положение. Вместе с тем большинство исследователей отмечают значительную лабильность структуры клеточных контактов, сопровождающуюся изменением их функционирования. В настоящее время накоплено довольно большое количество данных по изменению межклеточных контактов в жизненном цикле организмов, при патологических состояниях клеток, а также при ряде экспериментальных воздействий на них. Установленные факты лабильности отдельных компонентов контакта хорошо согласуются с наиболее распространенной сейчас жидкостно-мозаичной моделью организации клеточных мембран. В то же время в проблеме межклеточных контактов до сих пор остается много белых пятен, большинство из которых, однако, имеют частное значение.

Главным направлением дальнейших исследований становится поиск способов целенаправленных воздействий на контакты, поиск веществ, которые могли бы нормализовать функцию межклеточных контактов при различных патологических состояниях и заболеваниях, например при опухолевом росте. Метод ЗСТ, по-видимому, останется одним из главных инструментов в решении этой задачи.


## Глава 7

(Глава написана в соавторстве с В. А. Мироновым и Г. А. Алимовым.). КЛЕТОЧНЫЕ МЕМБРАНЫ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ. ЭЛЕМЕНТЫ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОГО МАТРИКСА

7.1. ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ ТКАНИ

Существует большое число попыток классифицировать эпителии различного типа на основании одного или нескольких признаков [29]. Новые возможности дает в этом направлении метод ЗСТ. Принимая во внимание степень развития ПК, ШК, десмосом и других межклеточных контактов, можно выделить следующие группы эпителиев.

Эпителии, основная функция которых - поддержание градиента (осмотического, коллоидного, ионного и т. д.) между микроокружением со стороны апикальной и базальной поверхностей. По степени развития барьерной функции они могут быть разбиты на несколько подгрупп: очень плотные (абсолютно непроницаемые), плотные (непроницаемые), умеренно плотные (умеренно проницаемые), неплотные (протекающие), текучие (не имеющие выраженной барьерной функции). Данная градация прежде всего принимает во внимание число контактных фибрилл ПК, непрерывность гребней, наличие ВМЧ и т. д. Поэтому часто теми же терминами классифицируются по своей структурно-функциональной характеристике и ПК.

Синцитиальные эпителии, где наибольшее развитие получают ЩК, хотя встречаются и другие виды соединений.

Опорные эпителии, которые отличаются тем, что клетки их соединены между собой десмосомами, гемидесмосомами, промежуточными контактами и выполняют опорно-механическую функцию.

Отметим, что при культивировании эпителии сохраняют строение межклеточных контактов. Есть основания рассматривать строение специализированных межклеточных контактов и их набор в качестве маркеров происхождения эпителиальных клеток [179].

После этих вводных замечаний мы очень кратко остановимся на эпителиях, которые встречаются во многих органах - мезотелии и многослойном плоском эпителии. Остальные будут рассматриваться в соответствующих разделах следующей главы.

Мезотелии. На сколах мезотелиоцитов часто встречаются вылущенные кавеолы в виде характерных шарообразных выпячиваний на EF-поверхности плазмалеммы, не формирующих линейных структур, Кр>1. На апикальной поверхности мезотелия видны редкие реснички, в цитоплазме описаны своеобразные длинные извилистые тубулярные профили, значение которых неясно [66].

Для мезотелия характерны два типа межклеточных щелей: между клеточными телами и между клеточными отростками. В первом случае чаще всего наблюдались ПК, представленные 2-3 анастомозирующими КФ. Связи между отростками мезотелиоцитов, а также между отростками и телами мезотелиальных клеток характеризуются чередованием ПК и ЩК. При этом гребни и бороздки, наблюдаемые соответственно на PF- и EF-поверхностях, образуют концентрически закрученные структуры, которые перемежаются с миниатюрными скоплениями глобулярных частиц, характерных для ЩК. Данное разнообразие связано с наличием в мезотелии декомплексированных участков [25].

В зонах сплошного монослоя встречаются ПК, представленные 2-5 анастомозирующими КФ, формирующими нерегулярную сеть. Нередко с ПК ассоциированы мелкие ЩК. Организация КФ и характер сколов ПК мезотелиоцитов очень напоминают таковые в эндотелии венул [462] (табл. XIV, а и б).

Многослойный плоский эпителий. Между его клетками встречаются десмосомы, ЩК и ПК. На базальной плазмалемме клеток базального слоя обнаружены нерегулярные скопления ВМЧ разного размера, что характерно для полудесмосом [190]. Плазмалемма в зоне расположения десмосом приподнята (PF) или опущена (EF) по сравнению с окружающей плазматической мембраной. В процессе кератинизации число ВМЧ на сколах десмосом уменьшается [455]. В роговом слое эпидермиса на сколах плазмалеммы клеток отсутствуют дискретные ВМЧ, однако видны плотно упакованные агрегаты ВМЧ [118]. В эпидермисе кожи в клетках Лангерганса десмосом не обнаружено [215]. ЩК невелики и обнаруживаются на плазмалеммах клеток базального, шиповатого и зернистого слоев. Точечные ПК изредка выявляются в промежуточных слоях клеток. ЩК и ПК никогда не встречаются в роговом слое. В первых слоях клеток рогового слоя плазмалемма содержит сильно развитую сеть канавок на PF-поверхности и гребней на EF. Они находятся в тесной связи с десмосомами. В межклеточных щелях на сколах обнаружено много своеобразных эллипсоидных ламеллярных телец на границе зернистого и рогового слоев [455]. Сходные тельца найдены и внутри клеток. Прилежащие друг к другу ламеллы в межклеточных щелях имеют тенденцию сливаться в широкие полоски. Ламеллярные тельца богаты липидами и, вероятно, переносят гидрофобный материал, обеспечивая барьерную функцию в межклеточных пространствах. Тельца образуют наружный липидный слой плазмалеммы, что стабилизирует межклеточную ламеллярную сеть [160]. Все эти перестройки знаменуют собой закономерный процесс дифференцировки клеточных мембран в процессе ороговения и слущивания клеток.

7.2. СОЕДИНИТЕЛЬНЫЕ ТКАНИ

Волокнистые и опорные соединительные ткани. К" плазмалеммы фибробластов больше 1, содержание в ней ВМЧ однородно [216]. С другой стороны, в культуре ткани обнаружено, что на самых концах отростков фибробластов, в том месте, где плазмалемма прикрепляется к субстрату, численная плотность ВМЧ увеличена, что рассматривается как концентрация белков, вовлеченных в адгезию и представляющих собой места связи с цитоскелетными элементами, которые участвуют в процессе прикрепления клеток к субстрату [419]. Эти зоны названы фибронексусами [470].

На репликах плазмалеммы фибробластов часто встречаются сколы кавеол, которые имеют тенденцию образовывать продольные ряды вдоль длинной оси клетки. Между рядами имеются участки плазмалеммы без везикул. Считается, что это обусловлено продольной ориентацией подмембранных пучков микрофибрилл [423]. В культуре ткани кавеолы трансформированных фибробластов у 48-63% образцов организованы в строгие линейные или веретенообразные агрегаты, ограниченные продольными гребнями и складками [470]. Фибробласты соединяются между собой с помощью ЩК, но не содержат ПК [388].

В культуре нормальных и трансформированных вирусом саркомы фибробластов обнаружены ЩК, имеющие довольно высокую ионную проводимость [387]. Они характеризуются квазигексагональной упаковкой коннексонов. Между агрегатами встречаются островки, свободные от ВМЧ. При трансформации указанная структура ЩК меняется. Кавеолы теряют линейную упаковку, что, по-видимому, обусловлено дезорганизацией структуры цитоскелета [388, 469].

В процессе эмбрионального развития внутреннее строение мембран фибробластов закономерно изменяется: число ВМЧ в плазмалемме вначале снижается, а затем (к моменту рождения) возрастает [216].

Плазмалемма остеобластов, заключенных в минерализированный матрикс, содержит мало ВМЧ [264], что свидетельствует об увеличении их способности к слиянию. В участках соприкосновения отростков остеобластов часто обнаруживаются ЩК [152].

В хондробластах, как и в фибробластах, на плазмалемме встречается множество сколов кавеол. Плазмалемма содержит довольно много ВМЧ диаметром 9.5-18 нм. Отростки тесно контактируют с хрящевым матриксом. В зоне пролиферации хряща ВМЧ сосредоточены на мембранах цитоплазматических отростков [497].

Изображение коллагеновых фибрилл на репликах варьирует в зависимости от особенностей препарирования объектов. При стандартной процедуре, когда скалывают фиксированную и криопротектированную ткань, коллагеновые фибриллы имеют вид продольных тяжей с периодическими поперечными утолщениями, расстояние между которыми составляет 60-70 нм. Длина поясообразного утолщения составляет 31 нм, а пояса сужения - 34 нм. В центре его и около одного из краев утолщения видны два ряда мелких частиц [202]. На продольных и поперечных сколах, обнажающих внутреннюю структуру фибрилл, центральная часть последней выглядит гомогенной, в то время как по периферии отмечаются отдельные точечные возвышения, напоминающие внутри-мембранные частицы.

В некоторых случаях, особенно после длительного ЗТ или после предварительной инкубации нефиксированных коллагеновых фибрилл в криопротекторах типа глицерина или диметилсульфоксида [497], на фоне явной гофрированности коллагеновых фибрил появляются признаки спирального расположения составляющих коллагеновую фибриллу микрофиламентов. Спираль имеет, как правило, правозакрученный ход. В каждой фибрилле диаметром около 300 нм выявлено до 500 микрофибрилл, покрытых общей оболочкой, которая и обусловливает периодичность [202].

Субмикроскопическая организация коллагеновых фибрилл неодинакова и зависит от молекулярного типа коллагена [408, 425]. Фибриллы коллагена I типа в фиброзной ткани характеризуются колебаниями своего диаметра от 20 до 400 нм и продольной упаковкой микрофибрилл. Изредка, однако, встречаются слегка волнистое и спиралевидное расположения с углом наклона 10°. Коллаген II типа (в гиалиновом и эластическом хрящах) также отличается значительным разбросом (40-400 нм) диаметра фибрилл, в которых микрофибриллы идут строго параллельно продольной оси фибриллы.

Фибриллы коллагена III типа (в рыхлой соединительной ткани) однородны по диаметру (80 нм) и имеют спиралевидную упаковку микрофибрилл с углом спирализации 18°. Сходной структурой, однако, обладают и коллагеновые фибриллы I типа из собственной пластинки роговицы.

Между отдельными коллагеновыми фибриллами в ряде случаев удается обнаружить связующие микрофиламенты, которые лучше проявляются при более длительном травлении, имеют диаметр, сравнимый с диаметром субъединиц коллагена, и располагаются вдоль оси фибриллы с интервалом 20 нм. Микрофиламенты, идущие через межфибриллярный матрикс, по-видимому, объединяют все фибриллы в единое целое.

Различие в характере получаемых изображений коллагеновых фибрилл породило ряд гипотез, объясняющих данные факты. На наш взгляд, наиболее обосновано представление о существовании вокруг коллагеновой фибриллы in vivo оболочки из сильно обводненного материала [74]. Неодинаковая скорость сублимации воды, приводящая к формированию поперечных поясов, обусловлена периодичностью в распределении различных типов молекул вокруг фибриллы. Логично ожидать, что в зоне так называемых поясков расположено либо больше протеогликанов, либо они имеют химическую природу и структурную организацию, обеспечивающие большую резистентность к сублимации льда. Длительное воздействие (травление, действие криопротекторов и т. п.) приводит к полному удалению воды из оболочки коллагеновой фибриллы и обнажает ее внутреннюю организацию, которая характеризуется тем, что микрофиламенты, спирально закрученные и связанные между собой системой межмолекулярных связей, формируют единую коллагеновую фибриллу (табл. XV).

Эластические волокна на репликах выглядят как сеть правильно организованных микрофибрилл, в которых определенная последовательность гидрофобных и гидрофильных участков формирует уникальные механохимические свойства эластического волокна.

Базальная мембрана, являющаяся одной из разновидностей экстраклеточного матрикса, на платиново-угольных репликах выявляется в виде неструктурированной гладкой гомогенной полосы, либо на месте расположения базальной мембраны отмечается определенная неровность, шероховатость, интерпретируемая как поперечные сколы формирующих базальную мембрану коллагеновых микрофиламентов [375]. В целом базальная мембрана как бы погружена в межклеточный матрикс, который на сколе имеет гладкую стекловидную поверхность. Однако использование метода СЗ-ГТ показало довольно сложную филаментозную организацию базальной мембраны. Последняя наиболее густая в области плотной пластинки, тогда как ее периферические слои внутри и снаружи намного беднее филаментами. Эти периферические участки прямо соединяются с базальной поверхностью эпителиальных клеток. Интерстициальный матрикс отличается более рыхлой упаковкой фибриллярного материала [248].

Жировая ткань. Скопления липидов в жировых клетках окружены гладкой, лишенной ВМЧ мембраной и часто имеют внутреннюю пластинчатую структуру. Плазмалемма адипоцитов включает обычное количество ВМЧ (Кp >1) и содержит кавеолы. Последние могут формировать небольшие кластеры. Между клетками обнаружены ЩК: в бурой жировой ткани мышей они занимают 1 - 2% площади плазмалеммы адипоцитов [139, 438]. В межлопаточной бурой жировой ткани крыс обнаружены плазмалеммо-митохондриальные контакты.

После рождения число и площадь ЩК прогрессивно нарастают вплоть до 17-х сут (у крыс). В этот период бурая жировая ткань наиболее функционально активна. В последующем эти параметры постепенно снижаются. У новорожденных мембраны"органоидов и липидных вакуолей нередко лишены ВМЧ [431].

При голодании глобулы липидов исчезают и появляются структуры, имеющие вид канальцев или цилиндров. Аналогичные изменения происходят и при других способах стимуляции липолиза [139]. Количественный анализ показал, что во время липолиза численная плотность кавеол и ВМЧ в плазмалемме возрастает, однако в пересчете на одну клетку их количество остается постоянным. Это свидетельствует о том, что общее число структурных компонентов, в том числе рецепторов, задействованных в процессе липолиза, является постоянной величиной [120].

При стимулированном липолизе в жировой ткани, если она обрабатывается в растворах с рН 9.0, образуются миелиновые фигуры, которые встречаются во внутриклеточных каналах адипоцитов, клеток интерстиция, эндотелиальных клеток, в просвете капилляров. На EF-поверхностях клеточных мембран обнаруживаются лишенные ВМЧ рифленые неправильной формы области, состоящие, по-видимому, из жирных кислот. Данный феномен обусловлен тем, что при рН 9.0 жирные кислоты входят в наружные слои мембран, перегружают их и вызывают рифление. На основании этих наблюдений были высказаны гипотетические идеи о путях транспорта жирных кислот из адипоцитов в эндотелиоциты капилляров [52].

Кровь. Кр плазмалеммы эритроцитов больше 1. Агрегации ВМЧ в интактных клетках не обнаружено [368]. Не выявлено существенных отличий в структуре мембраны у молодых и старых эритроцитов [330] млекопитающих разных видов [512]. Однако у плодов человека в эритроцитарных мембранах обнаружено увеличение по сравнению с эритроцитами взрослых людей числа ВМЧ на EF-поверхности на 45% и на PF на 24% [285].

При обработке филипином в плазмалемме интактных эритроцитов встречается относительно мало ФСД. Это связано с довольно высоким содержанием ВМЧ в плазмалемме. Действительно, в тенях эритроцитов после агрегации ВМЧ деформации в большом количестве появляются в зонах, свободных от частиц [101].

С помощью метода меченых сколов продемонстрировано соответствие распределения рецепторов фитогемагглютинина и ВМЧ [512]. Вакуолярные мембраны ядерных эритроцитов сильно обеднены белками, Кр может достигать 30 [16].

Внутреннее строение плазмалеммы эритроцитов во многом определяется функциональным состоянием клетки. При обратимом превращении дискоцитов в эхиноциты происходит перераспределение ВМЧ с их агрегацией в области спикул [127]. Перераспределение ВМЧ, по-видимому, связано с дефосфорилированием спектриновых молекул в результате снижения внутриклеточного содержания АТФ [11, 12].

Определенную роль в перераспределении ВМЧ в плазмалемме эритроцитов играет нарушение структуры цитоскелетной сети, служащей молекулярным якорем для интегральных белков [460].

Применение метода ЗСТ для изучения строения мембран эритроцитов позволило сформулировать гипотезу о важной роли генетических дефектов (недостатка ферментов) в строении мембран для патогенеза артериальной гипертензии [32].

Идентификация на репликах гранулоцитов базируется в основном на анализе строения мембран их гранул и плазмалеммы. На сколах нейтрофилов ВМЧ распределены случайным образом как на PF-, так и на EF-поверхностях. Изредка видны случайные сколы кавеол. Поперечные сколы клеток обнажают гранулы различных размеров, которые обычно не сливаются с плазмалеммой. Мембраны гранул содержат случайно-распределенные ВМЧ, которых на PF-поверхности меньше, но они более крупные. В секреторный процесс нейтрофилов вовлечены не только гранулы, но и плазмалемма кавеол [125].

В эозинофилах мембраны некоторых гранул содержат параллельные ряды ВМЧ [112]. В базофилах крови, так же как и в тканевых базофилах, на мембранах гранул кроме дискретных ВМЧ обнаружены цилиндрические или спиралеобразные пластинки, состоящие из параллельных рядов ВМЧ. Для тканевых базофилов продемонстрирована возможность освобождения содержимого гранул без разрыва диафрагмы между внутренностью гранулы и внеклеточной средой [130]. Считают также, что при дегрануляции тканевых базофилов возможно образование блебсов (плазмалеммальных пузырей), что позволяет выделять содержимое гранулы во внешнюю среду вместе с мембраной и освобождаться от ненужных липидов [296].

На плазмалемме лимфоцитов ВМЧ (диаметром 8-9 нм) распределены в основном случайным образом. Однако в некоторых случаях выявляются их скопления. Часто Кр<1. Один из возможных механизмов агрегации ВМЧ в плазмалемме лимфоцитов, по мнению некоторых авторов [31] , заключается в концентрации в этих участках F-актина. Сравнительные исследования лимфоцитов с ворсинчатой и гладкой поверхностями не выявили достоверных отличий ни в количестве, ни в диаметре ВМЧ [55, 410].

Предварительный анализ особенностей строения мембран различных типов лимфоцитов привел к неожиданным результатам. В отличие от В-лимфоцитов в Т-клетках выявились дискретные кластеры ВМЧ [312]. Однако затем [322] было доказано, что кластеры ВМЧ в нефиксированных лимфоцитах представляют собой артефакты. В то же время оказалось, что ВМЧ в Т-клетках легче агрегируют, чем в В-клетках, и что этот процесс в некоторых Т-лимфоцитах не предупреждается префиксацией [31]. Предполагается, что различия в мобильности ВМЧ в Т- и В-клетках могут быть связаны со строением субкортикальной сети микрофиламентов. Однако возникает вопрос, есть ли корреляция между движением, агрегацией и кэппингом маркеров клеточной поверхности и ВМЧ. Сравнительные исследования с лектинами и антителами [284] дали отрицательный ответ. С помощью метода ЗТ продемонстрировано, что иммуноглобулины распределены на поверхности В-лимфоцитов в виде микрокластеров [39].

Во многом сходная структура мембран обнаруживается на сколах моноцитов. Здесь встречаются секреторные гранулы, окруженные мембраной, которая часто сливается с плазмалеммой и на EF-поверхности скола содержит скопления ВМЧ. На PF-поверхности этот феномен выражен меньше [375].

В неактивированных тромбоцитах на плазмалемме число ВМЧ на EF-поверхности в 2.5 раза больше, чем на PF [521]. Суммарное число частиц на PF- и EF-поверхностях равно 1500 на 1 мкм. Кр плазмалеммы тромбоцитов не меняется при фиксации альдегидами. EF-поверхность плазмалеммы на репликах хорошо идентифицируется: она вогнута и содержит кратеры сколов производной плазмалеммы - внутренней канальцевой системы, которая участвует в увеличении поверхности тромбоцита после активации [542]. На сколах ее мембран обнаруживаются такие же ВМЧ, как и на плазмалемме. Микрофиламенты цитоскелета у покоящихся клеток располагаются вблизи внутренней стороны плазмалеммы в виде гексагональных и пентагональных структур [366].

Строение мембранных систем существенно меняется при активации тромбоцитов. ВМЧ плазмалеммы принимают участие в процессе агрегации тромбоцитов. После активации тромбоцитов, когда формируется фибрин, ВМЧ оказываются связанными преимущественно с внутренним слоем плазмалеммы, так как к ним прикрепляются филаменты актина [521]. Агрегация нередко приводит к формированию структур, напоминающих на ультратонких срезах ПК и ЩК, но не содержащих типичных для контактов ВМЧ [479].

В активированном состоянии у тромбоцитов под плазмалеммой формируются параллельные пучки микрофиламентов, проникающих в филоподии. Они соединены с небольшими полигональными сетями цитоскелета, лежащими непосредственно под клеточной мембраной. Все это приводит к изменению дискоидальной формы тромбоцитов [366].

При старении общее число ВМЧ на плазмалемме снижается. При этом Кр уменьшается, а количество ВМЧ на EF-поверхности скола возрастает. Текучесть мембран при старении падает, что связано, по-видимому, с заякориванием ВМЧ элементами цитоскелета [367].

7.3. МЫШЕЧНАЯ ТКАНЬ

На репликах поперечно-полосатых мышечных волокон чаще всего встречаются сколы митохондрий, элементов Т-системы и саркоплазматической сети.

Мембраны цистерн саркоплазматической сети, которые контактируют с митохондриями, содержат на PF-поверхности отдельные ВМЧ размером 20 нм, а также скопления, часто в виде рядов небольших ВМЧ. Агрегаты ВМЧ на терминальных цистернах связаны с соответствующими структурами на мембранах

Т-системы [164] и формируют электрические соединения между полостями трубочек и цистерн. В саркоплазматической сети большинство ВМЧ представляют собой Са-зависимую АТФазу, участвующую в мышечном расслаблении [94]. Общее количество ВМЧ в мембранах саркоплазматического ретикулюма у человека значительно выше, чем у исследованных животных [446].

С помощью методов СЗ-ГТ-КО подробно описана трехмерная организация пучков миофиламентов, в частности между миофиламентами визуализированы (чаще на уровне I-диска) поперечные мостики [30, 47].

На EF-поверхности сарколеммы видны устья трубочек Т-системы, сколы многочисленных кавеол. Кавеолы и трубочки часто трудно отличить друг от друга. Если PF-поверхность усеяна массой ВМЧ, то EF относительно гладкая. На плазмалемме обнаружены три типа ВМЧ-11 -12 нм (1-й тип), 14-15 нм (2-й тип), 20-21 нм (3-й тип), Кр=6. Численная плотность ВМЧ достигает на PF-поверхности 2000 ВМЧ на 1 мкм2. Квадратные агрегаты ВМЧ присутствуют на сарколемме быстрых мышечных волокон, однако их нет на оболочке медленных. ЩК и ПК в мышечных волокнах не найдены [243].

В быстрых волокнах кавеолы обычно группируются над местом расположения I-полоски [324], в медленных распределены по поверхности сарколеммы в основном случайным образом (табл. XVI). Численная плотность кавеол в быстрых мышечных волокнах меньше [324]. Сумма ВМЧ на PF- и EF-поверхностях скола ретикулюма в быстрых волокнах в 1.6 раза больше, чем в медленных [94]. Однако впоследствии эти данные не были подтверждены [446].

При обработке филипином ФСД найдены главным образом на поверхности плазмалеммы и поперечных трубочек. В саркоплазматическом ретикулюме ФСД встречаются реже, образуя кластеры, которые располагаются в промежуточных цистернах. Сарколемма медленных мышечных волокон имеет большую концентрацию холестерина, чем быстрых [444, 485].

Нейромышечным терминалям присуще строение, во многом аналогичное нервным синапсам, и выглядят они на тангенциальных сколах как серия узких складок, содержащих ряды сравнительно крупных ВМЧ. Углубления между складками заняты тонкими пальцевидными отростками шванновских клеток. В покоящихся терминалях прикрепленные синаптические пузырьки почти отсутствуют, сохраняясь в небольшом количестве лишь у внутренней поверхности пресинаптической плазмалеммы, которая почти не содержит ВМЧ. Характерные для пресинаптической мембраны двойные ряды ВМЧ диаметром 10-11 нм располагаются на PF-поверхности вершин складок напротив входа в открытые щели, образуемые сарколеммой [402].

ВМЧ, обнаруживаемые на PF-поверхности пресинаптической мембраны, делятся на два класса: мелкие (менее 9 нм) и крупные (9-13 нм в диаметре). Изредка встречаются сверхкрупные ВМЧ (более 13 нм). Непрямая стимуляция мышцы уменьшает концентрацию только мелких ВМЧ. Сходные отношения найдены на мембране синаптических везикул. На PF-поверхностях постсинаптических складок сарколеммы выявляются нерегулярно расположенные ряды плотно упакованных ВМЧ диаметром 11 -14 нм, соответствующих, по-видимому, молекулам ацетилхолиновых рецепторов. Эти ряды идут перпендикулярно длинной оси каждой складки и в глубине ее исчезают. Здесь же встречаются тетрагональные агрегаты ВМЧ диаметром 6 нм, которые, по-видимому, соответствуют молекулам АТФазы [357, 402].

ФСД обнаруживаются во всех участках мембран нейромышечных синапсов, за исключением области рядов ВМЧ на пре- и постсинаптических мембранах [357]. Это, возможно, обусловлено не отсутствием здесь холестерина, а жесткостью этих областей мембраны.

Строение агрегатов ВМЧ на сарколемме в нейромышечном соединении во многом определяется типом мышечного волокна. Показано, что после реиннервации медленного мышечного волокна нервом, ранее связанным с быстрой мышцей, на сарколемме появляются структуры, свойственные быстрому волокну [161].

В эмбриональном периоде формирование зрелых мышечных волокон осуществляется посредством слияния миобластов, в процессе которого, как показал метод ЗСТ, важное значение имеют микровезикулы, не содержащие ВМЧ. Слияние клеток происходит не конец в конец, а на уровне латеральных участков плазмалеммы. Имеется подробное описание механизмов реорганизации мембраны. Важную роль играют образующиеся между миобластами ЩК, которые участвуют в синхронизации работы миобластов и регулируют их слияние с помощью цАМФ [262, 403].

У эмбрионов лягушки на сколах плазмалеммы мышечных клеток, не обладающих чувствительностью к ацетилхолину, на PF-поверхности выявляются лишь маленькие (менее 9 нм) диффузно распределенные ВМЧ. По мере появления чувствительности к ацетилхолину на PF-поверхности скола обнаруживаются большие (11 нм) ВМЧ, численная плотность которых постепенно возрастает. На поздних стадиях эмбриогенеза формируются отдельные агрегаты больших частиц, которые рассматриваются в качестве кластеров рецепторов ацетилхолина [98]. Кроме того, с увеличением степени дифференцировки миобластов возрастает густота примембранного актинового цитоскелета [246].

Данные об изменении мембран мышечных волокон при мышечных дистрофиях противоречивы (см. обзор [459]). В экспериментах на цыплятах показано, что мышечная дистрофия вызывает существенные изменения в строении мембранных систем поперечнополосатого мышечного волокна, особенно в распределении кавеол в быстро сокращающихся мышцах. Упаковка везикул на плазмалемме становится диффузной, форма - неправильной, а число их у старых птиц возрастает. У человека при мышечной дистрофии распределение кавеол в быстрых волокнах также приобретает случайный характер. В медленно сокращающихся мышцах, где кавеолы в обычных условиях имеют случайное распределение, изменений в их упаковке при мышечной дистрофии не наблюдается [324].

В гладкомышечных клетках (ГМК) на EF-поверхности ядерной мембраны число ВМЧ больше, чем на PF [150]. На мембранах саркоплазматической сети количество ВМЧ на EF-поверхности в 1.5 раза выше, чем на PF. Число ВМЧ варьирует не только в разных клетках, но и в пределах одной ГМК. К плазмалеммы ГМК равен 1.5, а численная плотность ВМЧ на EF- и PF-поверхностях составляет соответственно 450 и 300 частиц на 1 мкм2. В зонах скопления плазмалеммальных кавеол число ВМЧ, особенно на PF-поверхности, существенно выше. Вокруг устьев кавеол, как правило, видны кольца и розетки ВМЧ. Показатели неравномерности в распределении ВМЧ в разных доменах плазматической мембраны ГМК и в разных органах оказались неодинаковыми. Плазмалемма ГМК часто образует ундулирующие складки [289]. Кавеолы здесь организованы в параллельные ряды. Встречается от 1 до 20 рядов, вытянутых вдоль длинной оси на большие расстояния. Дистанция между центрами соседних кавеол в пределах скопления составляет 85-115 нм, а численная плотность достигает 150 на 1 мкм2. Упаковка и содержание микровезикул неодинаковы в ГМК различных органов [505] (табл. XVII). Везикулы в ГМК являются аналогами Т-системы в скелетных мышцах. За счет кавеол площадь плазмалеммы увеличивается на 70% [187].

Зоны, свободные от кавеол, служат для прикрепления филаментов. После травления на внутренней поверхности плазмалеммы на этом участке видны фибриллярные структуры, соответствующие плотным тельцам (полоскам).

На плазмалемме ГМК в большом количестве обнаруживаются ЩК, содержащие 20 и более ВМЧ. Иногда выявляются короткие (10-15) и более длинные линейные ряды ВМЧ, которые часто вытянуты вдоль длинной оси клетки, перемежающиеся с продольными рядами везикул. Число подобных ЩК может достигать десятков и сотен на одну клетку. ЩК тесно связаны с саркоплазматическим ретикулюмом и митохондриями. Это обеспечивает передачу веществ, синтезируемых в цистернах ретикулюма, в другую клетку [187, 188].

Количество ЩК и их площадь зависят от анализируемого органа. В ГМК кишечника морской свинки ЩК занимают 0.2% плазмалеммы [187]. В зрачковом сфинктере морской свинки обнаружено 100 ЩК на клетку, что соответствовало 0.75% общей площади поверхности мембраны ГМК [183]. Даже в пределах одного органа (например, толстой кишки) различные слои ГМК связаны ЩК, отличающимися по своему строению [188]. Описаны ЩК между ГМК и фибробластами [186].

При расслаблении ГМК поверхность становится ровной, лишенной складок. Когда ГМК растягиваются (в 3 раза от своей первоначальной длины), прикрепленные везикулы уплощаются и превращаются в небольшие выпуклости плазмалеммы. Диаметр шейки кавеол при изотоническом сокращении не меняется. Моделирование процессов сокращения ГМК в условиях механической нагрузки показало, что чем сильнее укорочена ГМК, тем больше выражена складчатость ее плазмалеммы. Общее число кавеол и площадь поверхности ГМК не связаны со степенью сокращения [187]. Использование филипина обнаруживает в плазмалемме ГМК значительное количество холестерина [467]. Однако его содержание все же меньше, чем в эндотелиоцитах.

В синаптических окончаниях, обнаруживаемых на ГМК, ВМЧ на EF-поверхности пресинаптической мембраны собраны в диски и розетки. На PF-поверхности агрегаты ВМЧ таких структур не образуют [148].

Дифференцировка ГМК в процессе эмбрионального развития сопровождается закономерной реорганизацией их мембранных систем. У 11-суточных куриных эмбрионов численная плотность кавеол 1 на 1 мкм2, у 18-суточных - 5. Вначале они расположены диффузно, затем выстраиваются в ряды. Число ВМЧ во время эмбриогенеза остается более или менее постоянным [289].

Число и размеры ВМЧ на сколах мембран клеток сердечной мышцы варьируют у разных видов животных и в различных участках кардиомиоцита. Например, у овцы средний диаметр ВМЧ в предсердиях, пучке Гисса и в желудочках одинаков. Численная плотность ВМЧ и их общая площадь в предсердиях достоверно меньше, чем в желудочках. В пучке Гисса эти показатели занимают промежуточное положение. В желудочках распределение ВМЧ более равномерное, чем в предсердиях. ВМЧ у лягушки крупнее по сравнению с таковыми у курицы и кролика [277, 278]. Процент занимаемой ими площади у лягушек больше, чем у кур [277]. Фенестр в цистернах саркоплазматической сети обычно не наблюдается [46].

На сколах сарколеммы идентифицируется много кавеол, образующих скопления неправильной формы. На их мембранах агрегаты ВМЧ отсутствуют. Входы трубочек Т-системы имеют больший диаметр, чем везикулы. Они выступают на EF-поверхности и углублены на PF. Кроме того, в отличие от кавеол они, как правило, расположены на поперечных складках (табл. XVI, а и б). Полное расправление поверхностных складок при пассивном растяжении кардиомиоци-тов может привести к удлинению саркомера от 2.3 до 2.8 мкм [301].

С помощью метода СЗ-ГТ-КО между кардиомиоцитами найдены соединяющие их между собой и с коллагеновыми фибриллами филаменты диаметром 3-12 нм, примыкающие к гликокаликсу миоцитов [174].

Применение липидных зондов показало, что содержание стеролов и анионных фосфолипидов в мембранах кардиомиоцитов меньше, чем в скелетных мышцах [442].

В кардиомиоцитах обнаруживаются ЩК, десмосомы и промежуточные контакты. ЩК расположены преимущественно в продольных коленах вставочных дисков, промежуточные контакты - исключительно в поперечных, десмосомы - и в продольных, и в поперечных [443]. ЩК варьируют по размерам, форме и численной плотности коннексонов. Как правило, ЩК в миокарде представлены многочисленными группами гексагонально расположенных коннексонов [443J. Сарколемма, примыкающая к ЩК, часто содержит увеличенное число ВМЧ на PF-поверхности [454].

ЩК неравномерно распределены в различных отделах сердца и у разных видов животных [443]. В предсердии собаки они занимают примерно 6-7% всей площади вставочных дисков, в желудочке крысы - 10-13%, в волокнах проводящей системы сердца овцы - 17%. В процессе дифференцировки количество ВМЧ на сарколемме сердца эмбриона лягушки быстро увеличивается. ВМЧ на PF-поверхности крупнее, чем на EF [277].

На культуре сердечных миобластов зародыша курицы показано, что ЩК обнаруживаются между клетками с момента установления синхронных сокращений. В процессе развития по мере удлинения миобластов количество ЩК увеличивается. Вначале образуются линейные скопления ВМЧ. Затем появляются обычные ЩК с гексагональной упаковкой коннексонов. В дальнейшем идет быстрый рост ЩК до максимальных размеров, тогда как мелкие агрегаты ВМЧ сохраняются на всех стадиях развития. Формирование ЩК также может обеспечиваться за счет слияния небольших ЩК [359, 453].

Строение клеточных мембран кардиомиоцитов существенным образом зависит от их функционального состояния, уровня метаболизма и т. д. Оно меняется при ишемии и гипоксии, при варьировании внеклеточной концентрации ионов кальция. Уже через 10-40 мин после смерти коннексоны ЩК в миокарде не имеют гексагонального распределения [44].

7.4. НЕРВНАЯ ТКАНЬ

К плазмалеммы нервных клеток больше 1 как в центральной, так и в периферической нервной системе. Однако общее число ВМЧ в ЦНС, например на аксонах, выше. На основе этого показателя выделено несколько типов строения мембран в нервных клетках [292]; ВМЧ могут образовывать агрегаты с линейной и тетрагональной упаковкой, как например в астроцитах, где увеличена активность АТФазы. Содержание крупных (размером более 9.6 нм) ВМЧ на EF-поверхности плазмалеммы астроцитов увеличено [135], иногда агрегаты ВМЧ имеют форму кольца.

В отличие от большинства клеточных мембран К, аксолеммы около 1. Однако вблизи синаптического окончания количество ВМЧ на EF-поверхности плазмалеммы увеличивается. Часто они собраны в розетки разной величины. Шестиугольные розетки глобулярных ВМЧ найдены и на смежных участках плазмалеммы Щванновских клеток [334]. В области перехватов Ранвье аксолемма содержит относительно меньше ВМЧ на EF-поверхности [22]. Здесь же в значительно большем количестве встречаются крупные ВМЧ, упакованные в параллельные полосы шириной 25-30 нм и, по-видимому, связанные с обеспечением процессов возбудимости. Сходные ряды есть и на прилежащей плазмалемме шванновской клетки (здесь образуются септированные контакты) [434]. Данные о распределении ВМЧ хорошо коррелируют с результатами об асимметрии в содержании фосфолипидов. Последние в основном располагаются на цитоплазматической стороне мембраны, в то время как холестерин, не связывающийся с белком, находится на ее экстрацеллюлярной стороне [281].

Аксолемма в мякотных нервных волокнах отличается от таковой в безмякотных тем, что здесь, в паранодальной области, ВМЧ организованы в паракристаллы, а в нодальной области выявляются агрегаты ВМЧ, представляющие собой,вероятно, молекулы нативных "насосов". Эти структуры особенно хорошо видны на EF-поверхности [424].

В процессе роста нервного волокна, например при регенерации нерва, верхушка отростка нервной клетки содержит меньше ВМЧ, чем проксимальные участки. Это, по-видимому, связано с образованием новых порций апикальной мембраны из цитоплазматических везикул, мембрана которых лишена частиц [383].

Мембраны миелина до сих пор подвергаются тщательному анализу с помощью метода ЗСТ [82, 83, 189]. Содержание белков в миелине очень низкое [22]. На нефиксированных образцах ВМЧ имеют случайное распределение. При фиксации глютаральдегидом или при воздействии глицерина ВМЧ часто формируют сеть, иногда состоящую из правильно организованных агрегатов, которые перемежаются с ограниченными областями, свободными от частиц. Не исключено, что в фиксированных образцах агрегация ВМЧ обусловлена медленным проникновением фиксатора в ткань [434] (табл. XVIII и XIX).

Между мембранами миелина выявляются специализированные контакты, в частности ПК. Они располагаются в мезаксоне на уровне края последнего листка мембраны шванновской клетки и первого завитка ее вокруг аксона и имеют вид параллельных (с отдельными перерывами) рядов ВМЧ на PF-поверхности и комплементарных канавок с единичными ВМЧ на EF. Обычно обнаруживаются три параллельные КФ, которые иногда имеют волнистый ход и образуют слепо оканчивающиеся отроги. На нефиксированном материале ряды ВМЧ располагаются на EF-поверхности, а канавки - на PF. Подобные контакты обнаружены в нервных волокнах как центральной, так и периферической нервной системы и не только в наружных мезаксонах, но и в паранодальных петлях и насечках Шмидта-Лантермана [434]. Выявляемые ПК служат не только для механической стабилизации зрелых миелиновых оболочек, но и, по-видимому, выполняют роль диффузионного барьера, отделяющего компартмент внутри миелинового волокна от интерстиция, а также имеют важное значение в процессе миелинизации [149].

Метод ЗСТ помог решить вопрос о трехмерной организации мякотного нервного волокна [434]. Оказалось, что каждый сегмент миелина в периферической нервной системе формируется одной шванновской клеткой, которая представляет собой трапециевидную пластинку, закрученную вокруг аксона (рис. 13). Большая часть этой клетки занята дубликатурой противолежащих листков плазмалеммы, которые почти сливаются друг с другом (с образованием в области контакта внутренних поверхностей мембран плотной линии на ультратонких срезах). Цитоплазма сохраняется в зоне перикариона и также образует тонкий пояс по периферии пластинки. От них могут отходить поперечные и продольные слепые и сквозные цитоплазматические тяжи. Закручивание дубликатуры вокруг аксона и создает своеобразную структуру миелина с очень узкими межклеточными щелями между наружными листками плазмалеммы, которые изолированы от остального внеклеточного пространства системой ПК, которые сопровождают все (в том числе и краевые) цитоплазматические тяжи. Каждый миелиновый сегмент прикреплен к аксону в области перехватов Ранвье с помощью специализированных контактов, напоминающих септированные. Последние создают спиральную компартментализацию межклеточной щели в области перехвата Ранвье. В ЦНС каждая глиальная клетка образует несколько сходных трапециевидных пластинок, закрученных вокруг разных отростков нейронов и связанных с телом глиоцита тонким выростом цитоплазмы.

При миелинизации вначале (в эмбриональном периоде) выявляются короткие изолированные цепочки ВМЧ на противолежащих, смыкающихся над аксолеммой мембранах шванновской клетки (в так называемом наружном мезаксоне). На стадии прогрессирующей миелинизации эти элементы удлиняются, становятся многочисленными. На этом этапе они обнаруживаются в мембранах внутреннего мезаксона, в мембранах перехватов Ранвье и насечек Шмидта- Лантермана. В дальнейшем слияние изолированных точечных контактов приводит к образованию ПК, имеющих значительную протяженность. Наконец, появляется несколько параллельных КФ. Процесс миелинизации блокируется, если образования ПК не происходит [149]. Он сопровождается закономерным изменением распределения холестерина в пределах мембраны [165].

Рис. 13. Схема строения нервного волокна но данным метода ЗС (но: [434], с изменениями).

А - периферическая нервная система; Б и Д - центральная нервная система; В - строение ПК в области внутреннего и наружного мезаксона; Г и Д - схема, поясняющая механизм закручивания цитоплазмы швапновской клетки вокруг осевого цилиндра: 1 - ПК в области периферического утолщения цитоплазмы и ее тяжей, образующих при закручивании насечки Шмидта-Лантермана. В паранодальной области между аксолсммой и плазмалеммой швакковской клетки образуются септнрованные контакты (стрелки).

С помощью филипина и дигитонина обнаружено, что наибольшая концентрация стеролов имеется в плазмалемме щванновской клетки и аксолемме. В последней ФСД в изобилии встречаются в области перехватов Ранвье и редко в паранодальной аксолемме [83] .Отмечено, что филипин в компактный миелин практически не проникает [10] (табл. XVIII, б).

Олигодендроглиоциты содержат крупные высокие глобулярные ВМЧ, небольшие эллипсоидные частицы и короткие полоски из спаянных субъединиц. Установлено, что характерной особенностью плазмалеммы астроцитов является множество агрегатов ВМЧ с ортогональной упаковкой, которые, как предполагается, связаны с регуляцией объема клетки и выполняют функцию натриевых насосов [292, 310].

Коннексоны ЩК в астроцитах упакованы в кристаллоподобные ряды [316]. ЩК глии, по-видимому, осуществляют контроль ионного и нейротрансмиттерного гомеостаза при нейрональной активности [135, 136]. В то же время между клетками эпендимы имеются межклеточные контакты различного типа: ПК, ЩК, десмосомы, промежуточные контакты. ПК состоят из 3-12 параллельных, ветвящихся и анастомозирующих КФ. Однако с помощью комплементарных реплик показано, что 25% КФ имеют перерывы [522]. Апикальная плазмалемма содержит меньшее по сравнению с базолатеральной количество холестерина (по данным филипинового маркирования), что обусловлено ее участием в процессах всасывания и секреции [201].

В процессе индивидуального развития в клетках эпендимы происходит закономерное возрастание количества КФ и ПК и постепенное появление все более крупных ЩК. Вначале КФ представлены отдельными ВМЧ, затем их рядами, и наконец, они сливаются, образуя гребни. Доля площади плазмалеммы, занятая ЩК, с возрастом непрерывно увеличивается. Причем если на ранних стадиях эмбриогенеза ВМЧ обладают большим сродством к EF-поверхности, то при созревании это свойство меняется на противоположное [337].

Существенных межвидовых отличий в строении мембран синапсов не отмечено [319]. Идентификация четырех типов химических синапсов на репликах возможна лишь на поперечных сколах, когда доступны анализу те же признаки, что и на срезах. На тангенциальных сколах синапсы большой площади обычно представлены синапсами F- и S-типов, а небольшие округлые зоны контакта мембраны принадлежат синапсам С-типа [532] (табл. XIX, гид).

В синапсах химического типа активная зона пресинаптической мембраны содержит множество ВМЧ и кратерообразные структуры сколов кавеол диаметром 20 нм. На PF-поверхности имеются зубчатые выступы, занятые группами ВМЧ большого диаметра. Эти частицы и одиночные крупные ВМЧ на EF-поверхности пиноцитозных везикул взаимодействуют друг с другом, что, по-видимому, и является отражением слияния синаптических пузырьков с пресинаптической мембраной. Выступы имеют гексагональное расположение на плазмалемме [33, 45]. Есть указания на то, что глютаральдегид вызывает высвобождение синаптических везикул [50]. Процесс экзоцитоза синаптических везикул тщательно изучен с помощью метода СЗ-ГТ-КО [223, 226].

Для постсинаптической мембраны характерна четкая агрегация ВМЧ размером 8-13 нм, располагающихся на EF-поверхности скола против активной зоны пресинаптической мембраны. Численная плотность ВМЧ здесь 7500 на 1 мкм2, т. е. вдвое выше, чем на соседних участках. Есть указания, что эти ВМЧ представляют собой рецепторы молекул медиатора. В центре каждой ВМЧ обнаружен канал, аналогичный таковому в коннексонах ЩК [134].

Пресинаптические концевые утолщения заполнены сетью филаментов толщиной 5-7 нм, ассоциированных с гранулярным материалом. На поперечных сколах постсинаптической мембраны выявляются ряды стержневидных структур, диаметром 5-7 нм и длиной 15-30 нм, которые пересекают пресинаптическую щель и достигают наружной поверхности пресинаптической мембраны - это морфологический эквивалент трансмембранных рецепторов специфического медиатора [226].

Предполагается [134], что ВМЧ пресинаптической плазмалеммы являются ионными каналами, которые открываются под воздействием электрического импульса и инициируют поток ионов кальция внутрь клетки. Каждый канал состоит из пяти протеинов. Ионы кальция связываются с молекулой белка, названного фактором слияния. Соединяясь с кальцием, этот фактор переходит в активированное состояние и вызывает слияние синаптических везикул с пресинаптической мембраной и освобождение медиатора в синаптическую щель.

Молекулы медиатора открывают ионные каналы ВМЧ постсинаптической мембраны и вызывают ее деполяризацию. В инактивированном состоянии каналы закрыты [134].

Кроме химических синапсов в нервной системе найдены электрические, которые чаще являются дендродендритными или дендросоматическими и работают через встроенные в них ЩК- Они локализованы на относительно небольших дендритах мотонейронов. Обнаружены ЩК, соединяющие три нервных элемента [499, 506].

Описаны особые "фенестрированные" ЩК преимущественно на телах и больших дендритах мотонейронов. Подобные ЩК чаще всего ассоциированы со структурами, характерными для химических синапсов, - синаптическими везикулами околопресинаптической мембраны. На репликах среди коннексонов видны мелкие округлые участки гладкой мембраны. ЩК и вышеописанные смешанные синапсы обнаружены между нейронами, клетками эпендимы, астроцитами, олигодендроглиоцитами в самых различных отделах нервной системы большинства видов животных. Смешанные синапсы относятся к аксосоматическим и аксодендритным, а по структуре концевых отделов - к F- или S-типу синапсов [136, 506, 532].

В процессе индивидуального развития синаптические мебраны претерпевают существенные изменения. Размеры агрегатов ВМЧ и их распространенность возрастают, приобретая черты строения, свойственные взрослому организму [291, 319].

Между эндотелиальными клетками и перицитами в капиллярах коры головного мозга обнаружены ПК и ЩК [137, 356].

Описанные выше мембранные структуры, несмотря на аналогичное строение в пределах всей нервной ткани, в различных ее участках имеют определенные особенности, которые изменяются в процессе развития и при патологии. Этим вопросам посвящено огромное количество работ (см., например, [81, 274, 310] и др.).


Г лава 8 (Глава написана в соавторстве с В. А. Мироновым и Г. А. Алимовым.). СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН В НЕКОТОРЫХ ОРГАНАХ

8.1. ОРГАНЫ ЧУВСТВ

Диффузионный барьер между эндолимфой и перилимфой во внутреннем ухе обеспечивается развитыми непроницаемыми ПК- Нарушения их барьерной функции могут служить причиной нарушения слухового восприятия и головокружений. Между эпителиальными клетками, окружающими эндолимфу, найдены множественные ЩК [175, 228].

В статокинетическом отделе в рецепторной зоне вне области синаптических соединений с дендритами нейронов на основании волосковых клеток обнаружены ЩК, по-видимому, между волосковыми и опорными клетками, что делает логичным предположение о кооперации волосковых клеток [213]. ПК здесь имеют структурные харатеристики, свойственные непроницаемому типу. На базальной поверхности волосковых клеток встречаются области мембраны, характерные для синаптических соединений [63].

В улитковом протоке ПК, образующие периэндолимфатический барьер, располагаются вдоль апикального края латеральной плазмалеммы и состоят из большого числа КФ, количество которых между чувствительными эпителиальными клетками спирального органа, а также между базальными клетками сосудистой пластинки достигает 30 и более. Они относятся к абсолютно непроницаемому типу. На плазмалемме волосковых клеток встречаются три вида правильно упакованных агрегатов ВМЧ [210, 228, 503].

В то же время на волосковых и на гензеновских клетках спирального органа типичных ЩК не обнаружено. Между волосковыми клетками и дендритами нейронов спирального ганглия имеются синаптические соединения [210, 503].

В сосудистой полоске вся клеточная масса соединена ЩК- Между клетками пограничного слоя отмечаются ПК, в основном от умеренно непроницаемого до непроницаемого типа, встречаются (у человека) даже протекающие соединения. Промежуточные клетки лишены ПК. Базальные клетки связаны наиболее обширными ПК, имеющими уникальное строение - почти всю поверхность клетки покрывает сеть КФ [59, 64]. Это, по-видимому, обусловливает уникальный ионный состав улитковой эндолимфы и поддержание значительных градиентов. В то же время ПК в эндотелии кровеносных капилляров сосудистой полоски пропускают микропероксидазу, а в спиральной связке, как и в мозговых капиллярах, они непроницаемы [427].

В настоящее время ведутся интенсивные исследования уникальных мембранных структур органа слуха _и равновесия во время эмбриогенеза и раннего постнатального онтогенеза [78, 162].

Клетки заднего эпителия глаза соединены между собой с помощью ПК, которые имеют строение, характерное для непроницаемых эпителиев. В боковых отделах клеточных мембран обнаружены ЩК [232]. В процессе индивидуального развития строение ПК усложняется [339]. Основной тип контактов между эпителиоиитами венозного синуса и клетками трабекулярной сети - ЩК. На внутренней стенке синуса изредка встречались ПК точечного типа. Фибробласты собственной пластинки роговицы связаны друг с другом с помощью ЩК. Во время дифференцировки роговицы, с началом процесса ее обезвоживания, число ВМЧ на плазмалемме фибробластов за 3 сут увеличивается более чем в 2 раза и достигает 1300 на 1 мкм . ПК между эпителиальными клетками переднего эпителия роговицы представлены ПК точечного типа, десмосомами и ЩК, строение их обычно для многослойного плоского неороговевающего эпителия [216].

Между эпителиоподобными клетками, выстилающими спереди радужную оболочку, обнаружены точечные ПК и множество мелких ЩК. Межклеточные контакты (типичные ПК, ЩК и десмосомы) найдены и между клетками двухслойного эпителия на задней поверхности радужной оболочки. ПК встречались главным образом между непигментированными клетками. Число составляющих их КФ превышает 10.ЩК здесь выявляются редко. Однако они в большом количестве обнаружены между ГМК сфинктера и дилататора зрачка, что обеспечивает их точное и координированное сокращение [273].

Выстилающий цилиарное тело двухслойный эпителий имеет обычное строение межклеточных контактов. ЩК особенно многочисленны на границе между пигментированными и непигментированными эпителиальными клетками, что способствует объединению обоих слоев эпителия в метаболический синцитий. ПК также локализованы главным образом между непигментированными клетками, которые и выполняют в основном барьерную функцию. Число контактных фибрилл может доходить до 15, встречаются двойные и тройные полоски, что говорит об абсолютной непроницаемости ПК [406]. Эндотелиальные клетки, выстилающие капилляры сосудистой оболочки глаза, имеют обычное для фенестрированных эндотелиоцитов строение мембран [233].

В хрусталике клетки соединены между собой большим количеством ЩК, для которых наиболее частым и стабильным является разобщенное состояние. Если в корковом веществе в основном встречаются обычные ЩК с гексагональной упаковкой ВМЧ, то в ядре доминируют ЩК с тетрагональной упаковкой коннексонов. Между эпителиальными клетками передней поверхности хрусталика найдены структуры, похожие на ПК, что свидетельствует о существовании диффузионного барьера между передней камерой глаза и хрусталиком.

В процессе дифференцировки хрусталика происходит перестройка мембран образующих его эпителиальных клеток. Вначале формируется развитая система контактов, которая затем слегка редуцируется. При этом ЩК утрачивают кристаллическую упаковку [286, 287].

Между клетками пигментного эпителия сетчатки обнаружены непроницаемые ПК. На плазмалемме наружных сегментов фоторецепторов и пигментного эпителия встречаются циркулярные зоны, PF-поверхности которых лишены ВМЧ, а вокруг этих зон ВМЧ имели увеличенные размеры. Описано наличие выпуклостей диаметром 100 нм, покрывающих наружные сегменты фоторецепторов от начала до их основания. Мембраны дисков фоторецепторов клеток характеризовались наличием плотно упакованных крупных ВМЧ на PF-поверхности и меньшим числом ВМЧ на EF. В колбочках количество ядерных пор гораздо больше, чем в палочках [113, 323, 478].

Между самыми различными клетками сетчатки обнаружено множество ЩК В изобилии встречаются синаптические контакты как химического, так и смешанного типа. Во внутреннем сетчатом слое обнаружены синапсы лентовидной формы с характерным строением постсинаптической мембраны [406, 549]. Особенно сложно устроены синапсы между фоторецепторными и биполярными клетками, которые из-за своей формы называются инвагинирующими синапсами [405, 407].

Дифференцировка мембранных структур сетчатки сопровождается возрастанием численной плотности ВМЧ на PF-поверхности, оставаясь неизменной на EF. Взаимоотношения между клетками за счет формирования ЩК становятся все более сложными [80] (строение органов вкуса и обоняния изложено в разделах, посвященных системам пищеварения и дыхания соответственно).

8.2. КРОВЕНОСНЫЕ И ЛИМФАТИЧЕСКИЕ СОСУДЫ. ЭНДОТЕЛИЙ

Сложность идентификации сосудистого эндотелия на репликах выливается в две проблемы: как точно установить принадлежность анализируемого участка сколотой поверхности эндотелиальной клетке и, если это эндотелиоцит, какому отделу сосудистого русла он принадлежит. В качестве одного из критериев может выступать диаметр сосуда. Некоторые исследователи предлагают для идентификации просвета сосудов заполнять его частицами латекса [447]. Интересный подход реализован на сосудах сальника [465]: с помощью микродиссекции были выделены три группы сосудов сальника и уложены на объектодержатель в виде "поленницы дров", таким образом удавалось получать в большем количестве сколы сегментов микроциркуляторного русла. К сожалению, данный подход применим лишь для двухмерных органов.

Строение плазмалеммы эндотелиальных клеток также характеризуется определенной асимметричностью, Кр>1. Как правило, число ВМЧ больше на люминальной плазмалемме. Выраженность асимметрии зависит от сегмента сосуда, от органа, где расположен сосуд, и от уровня функциональной активности этого органа [447]. Плазмалемма эндотелиоцитов большинства кровеносных сосудов кролика (аорты, легочной артерии, легочных и сердечных капилляров) содержит значительное количество холестерина, что было продемонстрировано с помощью филипина и томатина. Однако в эндотелии задней полой вены содержание холестерина резко снижено [445].

Источником образования плазмалеммальных везикул эндотелиоцитов, вероятно, служат микродомены клеточных мембран, которые богаты моносахаридами [466]. На репликах после ГТ в эндотелиоцитах капилляров мышц и сердца обнаружено множество слившихся везикул. В быстро замороженных образцах везикулы имеют сферическую форму, а после химической фиксации выглядят овальными., Шейки прикрепленных к мембране везикул и соединенных частей слившихся везикул в быстро замороженных препаратах шире, чем в химически фиксированных. Показано, что отверстие везикулы не имеет диафрагмы. Лишь в 1.6% случаев везикулы не связаны с мембраной. PF-поверхность отдельных микровезикул бывает покрыта вытянутыми в меридиональном направлении структурами, имеющими актиновую природу [365] (табл. XX).

Численная плотность плазмалеммальных везикул в эндотелии капилляров колеблется от 10 до 110 на 1 мкм2. Причем содержание их на базальной плазмалемме всегда выше. Распределение кавеол неравномерно и обусловлено строением примембранного цитоскелета. Наряду с их случайным распределением, удалось выявить линейный, гексагональный и гроздевидный типы распределения везикул, прикрепленных к плазмалемме [6, 24]. Латеральная плазмалемма эндотелиальной клетки и околоконтактные зоны на базальном и люминальном участках поверхности эндотелия содержат кавеолы в очень ограниченном количестве [463]. В местах максимальной концентрации элементов цитоскелета микровезикулы практически отсутствуют [2, 6].

На тангенциальных сколах диафрагм прикрепленных везикул видны ВМЧ размером 10 нм, а на PF-поверхности прилежащей плазмалеммы встречаются кольца из ВМЧ. Очень часто диафрагма содержит одну более крупную центральную частицу. Везикулярные диафрагмы не метятся катионизированным ферритином [6, 72, 466]. Мембраны везикул содержат большое количество холестерина [444]. При слиянии двух микровезикул, связанных с люминальной и базальной плазмалеммами, формируются трансэндотелиальные каналы (их существование показано с помощью метода СЗ-ГТ-КО [365]).

Фенестры обычно располагаются в крайне истонченных (0.1 мкм) зонах эндотелиальных клеток. На репликах изображения фенестр напоминают картины разлома везикул, связанных с плазмалеммой: на EF-поверхности они имеют вид кратеров, на PF-поверхности - углублений, окруженных приподнятыми бортиками. Поскольку направление скола может локально варьировать, детали изображения фенестр (высота бортиков, ограничивающих кратеры, характер рельефа поверхности диафрагм и т. д.) на одной и той же реплике могут различаться (принцип формирования изображений фенестр на репликах см. на рис. 2, г). Сколы везикул и фенестр можно отличить по следующим признакам: 1) диаметр фенестр несколько больше (от 40 до 90 нм), 2) везикулы, как правило, распределены более случайно и нерегулярно, а фенестры образуют кластеры, 3) в пределах кластера фенестр обычно встречается переход линии раскола с PF-поверхности на EF и наоборот, 4) цитоплазма эндотелиальной клетки по мере приближения к кластеру фенестр все более истончается, везикулы же располагаются на всей поверхности эндотелиоцита независимо от толщины цитоплазмы (табл. XXI; см. также рис. 7).

Доля поверхности, занятая фенестрами, в эндотелиях разных сосудов существенно различается. Численная плотность фенестр варьирует от 10 до 120 на 1 мкм2 в зависимости от органа, возраста, пола и функционального состояния [6].

Фенестры, как уже указывалось ранее, чаще всего располагаются кластерами, для обозначения которых используются термины "решетчатые пластинки". Они большие по площади и неправильные по форме в эндотелии капилляров поджелудочной железы, маленькие и четко ограниченные в эндотелии капилляров кишечника. Внутри кластера фенестры иногда располагаются линейно со средним расстоянием между их центрами 130 нм [463]. Нередко линии фенестр в кластере идут во взаимопересекающихся направлениях [24]. Края эндотелиоцитов фенестрированного типа свободны от фенестр. Эта так называемая околоконтактная зона имеет ширину около 0.5 мкм. Иногда свободная от фенестр зона есть лишь у одной из двух смежных клеток. В таком случае говорят об асимметричных или неполных зонах [463].

Кластеры фенестр отделены друг от друга утолщенными тяжами цитоплазмы, свободными от фенестр [24, 178]. Эти цитоплазматические тяжи радиально идут от утолщенной ядросодержащей зоны клетки к периферическому околоконтактному цитоплазматическому утолщению. Цитоплазматические тяжи, содержащие микротрубочки и микрофиламенты, обеспечивают структурную стабильность областей, занятых фенестрами.

Число фенестр в кластере варьирует и может достигать 100 и более. Плотность и характер их распределения в пределах кластера также не везде одинаковы. Встречаются случайные, линейные и гексагональные типы распределений. Расстояния между центрами фенестр при этом различны, но в среднем, как правило, оказываются не менее 13 нм. Кластерный тип распределения наиболее ярко выражен в гломерулярных капиллярах почек [24]. Кластеризация фенестр и их упаковка в пределах кластера, возможно, обусловлены состоянием цитоскелетных элементов. Последние разделяют противолежащие участки поверхности эндотелиальной клетки и лишают их возможности сливаться (табл. XXII).

Фенестрированный эндотелий обладает очень значительными потенциями в осуществлении трансэндотелиального переноса. Реализация этих возможностей во многом зависит от транспортных свойств диафрагмы, которая перекрывает фенестру. На репликах удалось изучить пространственную организацию этих диафрагм. В центре диафрагмы было обнаружено миниатюрное колечко диаметром 2.5-3.5 нм, от которого к периферии расходились радиально ориентированные тяжи диаметром 4 нм. Эти рельефные образования построены из полимеров сульфатированных глюкозаминогликанов, которые являются молекулярным ситом и легко пропускают жидкость и ионы, но резко ограничивают просеивание макромолекул [467]. В последние годы эти наблюдения уточнены с помощью метода СЗ-ГТ-КО. Показано, что центральная "подушка" диафрагмы фенестр образована переплетением фибрилл, имеющих диаметр 10- 12 нм. Число фибрилл, конвергирующих в центре, варьирует от 9 до 21. Иногда 2-3 фибриллы объединяются в одну, что делает их подсчет затруднительным. Центральная сетчатая структура декорирована частицами диаметром 7-9 мкм [72].

Между радиальными фибриллами на периферии диафрагмы образуется не менее 10 сквозных отверстий клиновидной формы [502]. Максимальная их длина составила 5.46 нм. Кроме треугольных пор в центральной зоне встречаются более мелкие квадратные и щелевидные. В целом диафрагма имеет ортогональную симметрию. К ней прикрепляются частицы катионизированного ферритина, что говорит о наличии в диафрагме фиксированных отрицательных зарядов. Структура диафрагм фенестр из различных органов одинакова, однако особенности распределения анионных участков делают их свойства различными [72].

Средний диаметр фенестр равен 60 нм. Размеры фенестр варьируют в зависимости от органа и положения эндотелиоцита в пределах сосуда. В капиллярах они всегда оказываются меньше на артериальном конце.

Полученные результаты хорошо совпадают с экспериментальными данными по изучению проницаемости. Действительно, диафрагма фенестр (и прикрепленных везикул) не пропускает ферритин (величина молекулы 11 нм), но через нее легко проходит молекула пероксидазы хрена (диаметр 4.5). Стабилизация мембран в местах расположения фенестр и микровезикул обеспечивается холестерином, что было доказано с использованием его маркера - филипина. Интересно, что вокруг отверстий везикул обнаружено 6-8 ФСД, а вокруг фенестр их 10-12 [467].

Поры представляют собой сквозные отверстия в эндотелиальной слое, которые прямо соединяют просвет сосуда с периэндотелиальным пространством. Они локализуются в истонченных частях эндотелиоцита и образуются его плазмалеммой, непрерывно и плавно переходящей в каждом отверстии с люминальной поверхности клетки на базальную.

В отличие от фенестр поры полностью лишены диафрагм и, вероятно, поэтому их форма и размеры очень сильно варьируют. Недавно отсутствие диафрагм было подтверждено с помощью метода СЗ-ГТ-КО [72]. Но во всех случаях размеры пор бывают достаточно велики, чтобы через них беспрепятственно могли проходить растворы с микро- и макромолекулами. При этом крупные поры в состоянии обеспечивать трансэндотелиальный переход даже таких крупных "частиц", как клетки крови.

В отличие от фенестр поры характеризуются большей вариабельностью размеров и формы, а также отсутствием ВМЧ в плоскости устья [24] (табл. XXIII, б).

Механизм образования пор неизвестен. В ряде случаев они встречаются вместе с фенестрами. Весьма вероятно, что по крайней мере некоторые из пор являются производными фенестр. Кроме того, бороздка вокруг уплощенного участка мембраны также интерпретируется как стадия образования поры [303]. В синусоидах печени крупные поры в эндотелиоцитах также сгруппированы в кластеры. Нередко большие поры образуются двумя эндотелиоцита ми в зоне межклеточных контактов. В связи с тем что распределение пор и фенестр имеет сходный характер, предполагается, что цитоскелет детерминирует упорядоченность расположения, форму и размеры пор [6, 24, 547].

После ГТ в цитоплазме эндотелиоцитов обнаружена сеть тонких фибрилл.

Иногда они связывают везикулы друг с другом или с плазмалеммой. Эта сеть может играть определенную роль в стабилизации структуры и положения везикул, в регуляции передвижения и слияния некоторых люминальных кавеол с прилежащими базальными образованиями [365]. Поры могут формироваться под влиянием мигрирующих через эндотелий клеток крови (в костном мозге) и купферовских клеток (в печени).

В межклеточных щелях эндотелия встречаются два типа специализированных контактов: ПК и ЩК. Десмосомы и промежуточные контакты не идентифицируются [465]. Особенностью строения ПК в эндотелиоцитах является то, что при раскалывании ВМЧ часто остаются в углублениях EF-поверхности, а не на возвышениях PF, тогда как в других эпителиальных тканях ВМЧ, как правило, формируют гребни на возвышениях PF-поверхности [464]. Канавки на возвышениях PF-поверхности комплементарны по локализации гребням и рядам ВМЧ на EF. В венулах и в эмбриональных гемокапиллярах встречаются возвышения, полностью лишенные ВМЧ или содержащие единичные изолированные частицы. Они обозначены как лабильная, или абортивная, форма ПК [6, 340, 467] (табл. XXIII, а).

КФ ПК образуют в совокупности своеобразный обруч, который опоясывает эндотелиоциты и полностью перекрывает межклеточные промежутки. Нарушение непрерывности КФ определяет повышенную утечку макромолекул по парацеллюлярным межклеточным щелям в сосудистом эндотелии [6, 451, 548].

ЩК располагаются не только изолированно, но и в комбинации с ПК, что особенно характерно для эндотелия резистивных и емкостных сосудов [238, 464], и играют важную роль в метаболической кооперации эндотелиальных клеток и объединении последних в тканевую систему. Упаковка ВМЧ в ЩК варьирует от рыхлого, случайного распределения до плотного, гексагонального [293], а размеры ЩК колеблются от десятков до сотен нанометров.

В эндотелии отмечены вариации в частоте встречаемости ЩК. Например, в артериолярном эндотелии их больше, чем в капиллярном. Количество ЩК часто прямо коррелирует с интенсивностью пролиферации эндотелия [238, 464]. ЩК в совокупности могут занимать до нескольких процентов от общей площади латеральной поверхности эндотелиоцита. Десмосомы и промежуточные контакты, даже плохо развитые, в эндотелии не идентифицируются [465].

ЩК могут существовать между эндотелиальными клетками и перицитами или миоцитами. Они выявляются на базальной поверхности эндотелиоцита и свидетельствуют о тесной метаболической кооперации перицитов и ГМК с эндотелиоцитами [6]. Иногда отросток перицита или ГМК не просто примыкает к поверхности эндотелия, а проникает в соответствующую инвагинацию, где локализован ЩК. Коммуникационные свойства таких соединений подтверждены с помощью витальных красителей.

С ростом числа слоев ГМК в составе сосудистой стенки число ЩК между эндотелиальными клетками и ГМК уменьшается. Коммуникационные свойства этих соединений выше, чем в случае перицито-эндотелиальных контактов.

Плазмалемма перицитов и ГМК стенки сосудов метится филипином в меньшей степени, чем эндотелиальная [467].

В эндотелии лимфатических сосудов ПК имеют строение, характерное для эндотелиоцитов венул.

В клетках эндотелия эндокарда кролика ВМЧ распределены неравномерно на экстрацеллюлярной и цитоплазматической поверхностях. Их численная плотность на PF-поверхности в 2.3 раза выше, чем на EF. Число устьев пиноцитозных пузырьков вдоль базальной плазмалеммы несколько выше (29-43), чем вдоль люминальной (24-34 на 1 мкм2). ПК сходны с таковыми в эндотелии артерий и имеют вид переплетающихся контактных фибрилл длиной до 6 мкм. ЩК представляют собой скопления гексагонально расположенных частиц, иногда частичнЬ или полностью окруженных гребнями ПК. Имеются ветвящиеся или циркулярные ЩК, частицы которых лежат рядами. Они пропускают между клетками карбоксифлюоресцеин. Гребней ПК больше с желудочковой стороны клапанов, что показывает их зависимость от гидростатического давления. Уже после 5-10-минутной инкубации эндотелия эндокарда с филипином ФСД видны вокруг устьев пиноцитозных пузырьков, но даже при длительной инкубации они отсутствуют в зоне окаймленных везикул, ЩК и вдоль фибрилл ПК [307].

Около 12% поверхности плазмалеммы эндотелиальных клеток артерий покрыто везикулами. В межэндотелиальных щелях встречаются как ПК, так и ЩК. ПК выявляются на сколах в виде непрерывной сети. Гребни ПК состоят из частиц шаровидной или палочковидной формы размером 10 нм. Геометрия этой сети сходна с таковой ПК других эпителиальных тканей. Например, в грудном отделе аорты ПК состоят из одной или двух КФ, содержащих отдельные перерывы, а в ее крупных ветвях - из непрерывной поясовидной анастомозирующей сети, имеющей в среднем по шесть КФ [238]. Однако в эндотелии прямых участков грудного отдела аорты нам не удалось обнаружить перерывов в фибриллах ПК- ЩК имеют форму бляшки размером 80-800 нм [23].

В крупных мышечных артериях найдены так называемые эндотелиальные соединения, состоящие из перемежающихся рядов ПК и ЩК. Выделено два типа подобных соединений: первый представляет собой обычную комбинацию ПК и ЩК, но расположенных чередующимися слоями; второй тип более сложный и напоминает по внешнему виду септированные контакты с удлиненными крупными внутримембранными частицами. Обычно подобные контакты занимают лишь небольшой сектор периметра эндотелиоцита [238, 465].

В мелких мышечных артериях, например в мелких артериях легких, ПК состоит из 2-6 непрерывных взаимосвязанных КФ, образующих борозды на EF-поверхности и комплементарные им бедные частицами гребни на PF. В сети КФ ПК присутствует множество ЩК, коннексоны которых формируют ряды, параллельные плотным соединениям [436].

Строение межклеточных контактов эндотелиоцитов артерий обнаруживает корреляцию с их проницаемостью для высокомолекулярных соединений, причем они могут перестраиваться и становиться более проницаемыми под влиянием гемодинамических факторов и вазоактивных агентов [23]. Базальная поверхность эндотелия изредка содержит миоэндотелиальные ЩК, которые играют важнейшую роль в регуляции и координации функций эндотелия и ГМК артерий.

При использовании метода ЗС артериолы идентифицируются по наличию мышечного слоя стенки и по строению специализированных межэндотелиальных контактов. Между эндотелиальными клетками артериол обнаружены ПК и ЩК- Первые представлены 2-6 КФ, которые формируют непрерывную непроницаемую сеть. КФ, образующие гребни в углублениях на EF-поверхности, практически не имеют перерывов и могут тянуться на расстояние 10-12 мкм. Лишь немногие из них имеют слепые окончания. Ячейки сети ПК полностью или частично заняты ЩК, которые, за исключением локализации, имеют обычный вид. Изолированные ЩК встречаются доволно редко [435, 464]. Число миоэндо-телиальных ЩК возрастает по направлению к капиллярам.

В клетках эндотелия капилляров происходит дальнейшая редукция специализированных межэндотелиальных контактов. ПК здесь состоят из 1-5 рядов ВМЧ [6]. Расстояние между частицами, как правило, больше, чем в соответствующих структурах артериол. КФ могут быть непрерывными и соединяться друг с другом либо иметь зигзагообразный вид. В некоторых случаях КФ в эндотелии капилляров ветвятся. До сих пор остается неясным, образуют ли они законченный пояс вокруг эндотелиоцита. В этой очень слабо развитой анастомозирующей сети можно проследить перерывы в поясе КФ.

На сколах артериолярного конца капилляров число кавеол на плазмалемме перицитов значительно меньше, чем на цитоплазматической мембране эндотелиальных клеток. Причем размеры устьев микровезикул больше варьируют, чем в эндотелиоцитах. Количество ВМЧ на сколах плазмалемм приблизительно одинаково.

Строение ПК в эндотелиоцитах капилляров различается в зависимости от органа и типа эндотелиальных клеток.

Так, в капиллярах респираторной зоны легких ПК состоит из 1-3 параллельных, иногда анастомозирующих КФ, которые представлены рядами ВМЧ, локализованных на низких возвышениях PF-поверхности или (чаще) в мелких бороздах на EF. Дискретные ВМЧ имеют, как правило, округлую форму, реже они образуют короткие гребни [435]. В капиллярах головного мозга ПК между эндотелиоцитами имеют вид множества непрерывных параллельных фибрилл [356].

Особенностью строения эндотелия синусоидов печени на репликах является присутствие множества сколов пор диаметром от 40 до 600 нм [245]. Диаметр варьирует в указанных пределах в одной и той же эндотелиальной клетке. Мелкие поры могут сливаться и образовывать фигуру в форме восьмерки. Вокруг фенестр и пор после травления можно обнаружить пучки филаментов, которые ограничивают дальнейшее слияние пор. Это свидетельствует о том, что перфорированные зоны в эндотелии синусоидов печени являются очень динамичными образованиями [341]. Более крупные поры обнаруживаются редко [245].

В фенестрированных капиллярах также выявлены элементы ПК, гребни которых, однако, видны лишь при очень малом угле напыления или отсутствуют совсем [490]. КФ имеют частые перерывы, т. е. в фенестрированных капиллярах присутствуют ПК, сходные с ПК венулярных отделов микрососудов [435]. В легких в венулярных концах кровеносных капилляров ПК состоят из простой сети, образованной 2-4 широкими низкопрофильными гребнями на PF-поверхности, которые усеяны небольшим числом ВМЧ, реже - короткими сегментами фибрилл. EF-поверхность характеризуется наличием неглубоких желобков, также содержащих немногочисленные ВМЧ. Гребни могут слепо оканчиваться на гладкой поверхности скола.

В ходе постнатального онтогенеза описано два направления дифференцировки эндотелиоцитов. В фенестрированных эндотелиоцитах перитубулярных кровеносных капилляров почки крысы происходит увеличение численной плотности фенестр, причем нарастание числа фенестр у старых крыс может приводить к их гексагональной упаковке. Ведущей тенденцией на протяжении всего постнатального онтогенеза является прогрессирующая гемиарборизация цитоплазмы эндотелиальных клеток. Напротив, в печени в эндотелии синусоидного типа с возрастом количество пор и фенестр уменьшается. ЩК в эндотелии капилляров не обнаружены [26, 27].

В микрососудах селезенки специализированные межэндотелиальные контакты встречаются лишь в местах соприкосновения боковых отростков соседних эндотелиоцитов.

ПК между эндотелиальными клетками венул еще более редуцированы. ВМЧ, присутствующие на сколах фибрилл, здесь чаще остаются на возвышениях PF-поверхности и отсутствуют на бороздах EF, т. е. здесь взаимодействие частиц в парах ВМЧ, по-видимому, слабее [464].

В перицитарных венулах ПК выглядят как скопление разрозненных гребней (на PF) и борозд (на EF), которые часто имеют свободные концы. Они, как правило, формируют прямые линии довольно постоянной длины, которые часто располагаются под острым углом, где могут соединяться. Их ориентация относительно базальной плазмалеммы варьирует от параллельной до перпендикулярной. На гребнях PF-поверхности обнаруживаются ВМЧ, количество которых варьирует. Борозды на EF-поверхности обычно свободны от частиц. В зоне ПК имеются многочисленные проходы через пояс ПК от люминальной до базальной стороны сети КФ- ЩК не обнаруживаются [464].

В мышечных венулах уже встречаются небольшие ЩК, связанные с системой низкопрофильных гребней и борозд ПК, но окруженные КФ- Изолированные ЩК встречаются редко. Зачастую специализированные контакты отсутствуют совсем. Эндотелий венул оказался среди других сосудистых сегментов наиболее чувствительным к вазоактивным веществам, которые индуцируют открытие межэндотелиальных контактов. Это, по-видимому, обусловлено указанными особенностями строения [6, 464].

Венулы в тканях мозга характеризуются наличием между эндотелиоцитами прерывистых единичных или двойных КФ ПК, связанных с ЩК- Интересно, что введение в сосуды мозга гипертонического раствора маннитола не меняет структуру ПК между эндотелиоцитами [356].

В крупных венах межэндотелиальные ПК имеют меньшую выраженность, чем в артериях. Они непрерывны на значительном протяжении и часто соединены с ЩК, которые являются как бы продолжением фибрилл ПК. Встречаются, однако, участки, где ПК имеют строение, аналогичное таковому в эндотелии венул. КФ проходят параллельно базальной мембране эндотелия. Число гребней невелико (3-5), но они дают ответвления и таким образом формируют сложное переплетение. В венах, как и в артериях, гребни из ВМЧ часто локализованы на EF-поверхности [465]. Описанная картина варьирует в разных органах. ЩК, как правило, более мелкие, чем в артериях, и встречаются реже [436, 465].

При использовании филипина и томатина эндотелий задней полой вены кроликов оказался резистентным к этим агентам, что свидетельствует о более низком, чем в других сосудистых сегментах, содержании холестерина [445].

Метод ЗСТ оказался полезен для изучения перестроек элементов сосудистой стенки в условиях патологии. Так, например, удалось установить, что при гипертензии отношение поверхности ПК и латеральной поверхности эндотелиальных клеток в аорте увеличивается. Возрастало также разнообразие форм ПК, ЩК приобретали неправильную форму [23]. Показано, что между ГМК в миоинтимальных утолщениях в стенке артерий образуются ЩК [51, 136].

Относительно формирования межклеточных контактов в эндотелии при регенерации единого мнения не существует. Так, Щварц с соавторами [439] не обнаружил ПК и ЩК в регенерирующем эндотелии артерий вплоть до полного восстановления целостности пласта. Напротив, Спаньоли с соавторами [487] продемонстрировал лишь снижение числа и площади ЩК. Отмечено, что число и размеры ЩК обратно пропорциональны индексу меченых ядер. Однако в последние годы получены данные, указывающие на то, что и в регенерирующем эндотелии аорты показатели сложности ПК и площади ЩК выше, чем в норме. Установлено также, что в регенерирующем эндотелии аорты ФСД малочисленны в местах прикрепления сократительных фибрилл, но на остальных участках плазмалеммы они выявляются в больших количествах [239].

В культуре ткани специализированные контакты между эндотелиоцитами в основном сохраняют строение, характерное для них in situ. Так, в монослое эндотелиоцитов из полой вены кролика были идентифицированы типичные ЩК, тогда как ПК в нем отсутствуют. При этом сохранялась асимметричность распределения ВМЧ между PF- и EF-поверхностями плазмалеммы. Кавеолы имели тенденцию к образованию довольно крупных агрегатов, которые разделялись областями, не содержащими микровезикул [303].

Контакты между эндотелиоцитами фенестрированного типа способны образовывать фенестры in vitro, причем диафрагма фенестры при этом имеет точно такое же строение, как и in situ.

Формирование ПК in vitro, характерное для эндотелия капилляров мозга, зависит от выделяемого астроцитами фактора роста и внеклеточного матрикса фибронектина, образуемого эндотелиоцитами. Под действием гиперосмотических растворов (например, арабинозы) выявленные in vitro ПК между эндотелиальными клетками капилляров мозга раскрывались [151].

Таким образом, применение ЗСТ позволило расшифровать многие структурно-функциональные механизмы тканевой биологии сосудистой стенки.

8.3. ЖЕЛЕЗЫ ВНУТРЕННЕЙ СЕКРЕЦИИ

Цитоскелет железистых клеток аденогипофиза представлен тремя типами фибрилл (ассоциативными, соединяющими и связующими) и контролирует транспорт секреторных гранул [440]. На отдельных участках плазмалеммы видны скопления ВМЧ диаметром 14 нм, которые рассматриваются как начальные этапы слияния мембран в процессах эндо- и экзоцитоза [40]. Как правило, содержимое секреторных гранул выделяется в интерстиций через отверстие на вершине выступов клеточной поверхности, образованных благодаря давлению секреторных гранул на внутреннюю поверхность плазмалеммы [140].

Между гранулярными клетками аденогипофиза обнаружены десмосомы, полудесмосомы и соединения типа ПК. Полудесмосомы, расположенные поблизости от ПК, не содержат пластинок прикрепления и связанных с ними тоно-филаментов.

Некоторые эндокринные клетки соединены друг с другом с помощью типичных ЩК [171, 221].

В железистых клетках надпочечников на PF-поверхности внутренних мембран митохондрий место отхождения кристы имеет вид округлого углубления с плоским дном. Обнаружены точечные места слияния внутренней и наружной мембран митохондрий.

Между эпителиальными клетками имеется большое количество ЩК, размеры которых наиболее велики во внутренней пучковой и сетчатой зонах и минимальны в клубочковой зоне. В надпочечниках крыс между клетками трех главных зон коркового вещества найдены соединения, напоминающие септированные контакты. Однако строение плазмалеммы в этой области существенно не отличается от ее структуры вне этих зон. ПК имеют слабое развитие и чаще всего представлены точечными ПК [182].

В клетках мозгового вещества надпочечников поры на ядерной оболочке располагаются рядами или формируют очаговые скопления. Клеточные мембраны содержат два вида ВМЧ: первые (величиной 4-6 нм) более многочисленны в участках контактных зон и синапсов, вторые (размером 12-15 нм) - во внутриклеточных мембранах. Между клетками имеются обычные ЩК [280].

В эмбриональном периоде появления ЩК между соседними эпителиоцитами коркового вещества является одним из наиболее ранних признаков морфологической дифференцировки надпочечников у млекопитающих и непосредственно предшествует началу стероидогенеза; так, у плодов крысы и мыши это происходит за кеут до пролиферации элементов гладкой ЦПС и везикулярных изменений в кристах митохондрий, которые рассматриваются как морфологические признаки, указывающие на стероидогенез. Возникновение ЩК, по-видимому, синхронизирует стероидогенез эпителиоцитов [144].

После рождения, по мере того как клетки клубочковой зоны приобретают характер функционально активных клеток, рудиментарные десмосомы, встречающиеся между эпителиоцитами в первые сутки и недели после рождения, исчезают, заменяясь ЩК- В пучковой и сетчатой зонах, клетки которых к моменту рождения уже имеют признаки активной секреции стероидных гормонов, ЩК, ПК и десмосомы обнаруживаются уже в 1-е сут после рождения. Вероятно, ЩК метаболически ускоряют дифференцировку клетки за счет активного обмена между клетками ионов и молекул веществ-регуляторов [378].

В щитовидной железе Кр плазмалеммы тироцитов равен 2-3. Количество ВМЧ на PF-поверхности скола достигает 700, а на EF - 250 на 1 мкм2. Мембрана, ограничивающая коллоидсодержащие гранулы в апикальной цитоплазме, также включает довольно много ВМЧ [185]. Изредка на апикальной поверхности тироцитов обнаруживаются сколы ресничек, которые у основания (шейки) содержат так называемое цилиарное ожерелье (см. гл. 5).

На боковой плазмалемме в апикальной части клетки обнаруживаются ПК-КФ их анастомозируют и практически лишены перерывов [510]. Количество КФ в ПК варьирует от 2 до 8 (у крысы). ПК относятся к плотному непроницаемому типу. У кролика количество КФ больше (4-12). У места соединения трех соседних тироцитов количество КФ возрастает до 20. Изредка ниже сети ПК видны macula occludens, не связанные с фибриллами ПК. Ниже петель ПК, а также в ячейках сети фибрилл встречаются многочисленные ЩК, имеющие типичное строение. Несколько реже, чем у крыс, ЩК встречаются в щитовидной железе кроликов (табл. XXIV). Десмосомы, как правило, располагаются около базальных петель КФ ПК [510].

У куриных эмбрионов первичный просвет фолликулов в щитовидной железе появляется между двумя клетками обычно на 8-е сут после начала высиживания. Он образуется недалеко от точечных ПК или коротких дискретных КФ, которые при формировании фолликула превращаются в типичные ПК- Уже у 14-суточного эмбриона обнаруживаются типичные фолликулы, просвет которых изолирован от интерстиция с помощью ПК- Расположение КФ в них становится более компактным, а их число возрастает. У 19-суточных эмбрионов кур ПК выглядят почти так же, как у взрослых кур [511].

У 15-16-суточных эмбрионов крысы еще нет типичных ПК в тироцитах щитовидной железы. Они представлены единичными гребнями (на PF) и канавками (на EF). У 18-20-суточных эмбрионов (когда начинается синтез гормонов железы) появляются типичные ПК, число КФ в которых постепенно нарастает. Следовательно, коллоид с самого начала своего образования надежно изолирован от окружающей мезенхимы. ЩК появляются на 7-е сут, причем в ходе развития размеры их увеличиваются [304, 305].

В различных функциональных условиях строение мембран клеток тироцитов изменяется. Например, при введении тиреотропного гормона на апикальной плазмалемме формируются скопления ВМЧ (на PF). Каждое скопление имеет диаметр около 200 нм и состоит из 15-25 крупных ВМЧ размером 15-20 нм. По-видимому, скопление ВМЧ - начальная стадия эндоцитоза коллоида. Кроме того, стимулирование выделения гормона вызывает появление поясов ПК между тироцитами (иногда в пределах одной клетки). Увеличивается плотность расположения фенестр в эндотелиоцитах перифолликулярных капилляров. Напротив, этот параметр снижается при ингибировании секреции тиреоидином. Причем если в первом случае ширина зоны плазмалеммы, свободной от фенестр, уменьшается, то во втором возрастает [245].

Между главными клетками, имеющими на сколах более удлиненную форму, обнаруживаются интердигитации и десмосомы. В цитоплазме этих клеток видны сколы многочисленных митохондрий. Пластинчатый комплекс (Гольджи) выявляется только на сколах "светлых" клеток. Выделяемое содержимое имеет вид уплощенных конгломератов.

Между главными клетками околощитовидной железы встречаются слаборазвитые ПК, ЩК и десмосомы, имеющие обычное строение. На сколах хорошо видно, что отростки главных клеток проникают в цитоплазму соседних "светлых" клеток. В этих участках чаще всего и встречаются точечные ПК [404, 441]. Очень часто видны картины экзоцитоза секреторных гранул в межклеточные щели.

Обнаружена тесная связь строения мембранных систем клеток с функциональной активностью железы. Например, стимуляция функции железы (особенно в случаях острого гиперпаратиреоза) характеризуется увеличением числа ядерных пор [509].

На тангенциальных сколах плазмалеммы клеток эпифиза изредка встречаются так называемые синаптические ленты, рядом с которыми располагаются околосинаптические везикулы. На плазмалемме аксонов нервных терминалей в зонах контактов со шванновскими клетками найдены агрегаты ВМЧ с диагональной упаковкой частиц. Между пинеалоцитами описано три типа ЩК. Первый и второй встречаются более часто и характеризуются наличием нерегулярных агрегатов ВМЧ. Диаметр агрегатов варьирует от 100 до 250 нм. Контакты третьего типа имеют большую площадь (до 0.4 мкм2) и более регулярную упаковку ВМЧ. Эти области ЩК соответствуют электрическим синапсам и обеспечивают электрическое соединение пинеалоцитов [282, 283].

8.4. ОРГАНЫ КРОВЕТВОРЕНИЯ И ИММУНИТЕТА

В красном костном мозге между ретикулярными клетками, макрофагами, а также между ретикулярными клетками и незрелыми нейтрофилами, эозинофилами, моноцитами, эритробластами обнаружены ЩК [116]. При образовании тромбоцитов трубчатые инвагинации плазмалеммы мегакариоцитов частоколом отделяют формирующуюся клетку от остальной цитоплазмы и затем сливаются с противолежащей плазмалеммой и между собой с образованием двух непрерывных мембран. При тромбоцитопении слияние мембран тубулярной системы нарушено, на них встречаются участки, лишенные ВМЧ [77]. На сколах между эндотелиоцитами синусоидов костного мозга ПК не обнаруживаются [507].

На сколах плазмалеммы ретикулоэндотелиальных клеток тимуса обнаруживаются десмосомы и слабо выраженные ПК- Десмосомоподобные скопления ВМЧ присутствуют и между лимфоидными клетками. По мере созревания последних десмосомы встречаются все реже [214].

Эндотелиальные клетки, выстилающие синусы селезенки, образуют между собой ПК и промежуточные контакты, которые, однако, встречаются редко и не препятствуют миграции клеток крови через стенки синуса [375].

8.5 ОРГАНЫ ПИЩЕВАРЕНИЯ

Между одонтобластами пульпы зуба, а также между ними и клетками субодонтобластического слоя обнаружены ЩК [276]. У основания дентиновых отростков одонтобластов встречается анастомозирующая умеренно плотная сеть КФ ПК, которая имеет ограниченную протяженность и не обеспечивает герметизации пульпарно-предентинового барьера. На базальных и латеральных поверхностях одонтобластов обнаружены десмосомы [79, 428].

У человека в пульпе коренных зубов лишь 5% кровеносных капилляров имеют фенестрированные эндотелиальные клетки, между которыми встречаются слаборазвитые ПК [275].

На ранних стадиях дифференцировки зуба кубовидные преамалобласты в области дистальных полюсов соединены ЩК, а в области проксимальных полюсов ЩК обнаружены между преамалобластами и клетками промежуточного слоя [428, 540]. При формировании столбчатых амелобластов ЩК сохраняются. Содержание ВМЧ в плазмалемме возрастает [539]. В зависимости от уровня синтетической активности плазмалемма проксимальных отростков амелобластов претерпевает закономерные изменения, становясь то гладкой, то гофрированной. Это отражается на структуре эмали [ 197]. В проксимальном отделе боковой плазмалеммы между базальным выростом и содержащей митохондрии зоной амелобласта обнаружены ПК, состоящие из неполного пояса анастамозирующих КФ, которые часто прерываются, а местами совсем отсутствуют.


ПК нередко выглядят как macula occludens, присоединенная к ЩК, последние состоят из агрегатов ВМЧ, перемежающихся с полосками, свободными от частиц.

ПК между дистальными частями латеральной плазмалеммы амелобластов состоят из прерывистых КФ и часто имеют вид отдельных разнонаправленных штрихов.

Во вкусовых луковицах языка микроворсинки на поверхности клеток I типа имеют высокую плотность ВМЧ. Микроворсинки клеток II типа и особенно короткие микроворсинки клеток, расположенных по периферии вкусовой поры, имеют более низкую плотность ВМЧ. Единственная микроворсинка у клеток III типа содержит лишь несколько ВМЧ и пузырьковидное выпячивание мембраны, обращенное к цитоплазме. На поперечных сколах всех микроворсинок видны микрофиламенты [249]. На боковой плазмалемме клеток вкусовой луковицы обнаружены ПК и десмосомы. ПК представлены непрерывной сетью контактных фибрилл, которые широко ветвятся и анастомозируют. Они окружают не только клетки вкусовой поры, но и соседние эпителиальные клетки. Тем самым межклеточные пространства отделяются от поры вкусовой луковицы.

Десмосомы между клетками вкусовой луковицы меньше по площади, но плотность их выше, чем в окружающем эпителии. Они расположены под зоной ПК и встречаются через регулярные интервалы [48].

На PF-поверхности латеральной и базальной плазмалемм ацинарных клеток слюнных желез численная плотность ВМЧ настолько велика, что они выглядят полностью гранулированными. На PF-поверхности плазмалеммы вставочных протоков количество ВМЧ значительно меньше, и, наконец, меньше всего их обнаруживается на плазмалемме клеток протоков. Люминальная плазмалемма содержит на PF-поверхности уже существенно меньше ВМЧ, чем базолатеральная [142].

Во время выделения секреторных гранул люминальная плазмалемма приобретает мозаичную организацию, которая обусловлена наличием участков с высоким (оригинальная плазмалемма) и низким (мембрана гранул) содержанием ВМЧ. Переход между этими участками очень резкий. При этом перемешивания этих структурных компонентов не наблюдается, а разные участки мембраны сохраняют свои специфические структурные характеристики. Изначальная структура апикальной плазмалеммы восстанавливается за счет удаления из нее областей с низким содержанием ВМЧ [142]. Подобное явление происходит и в мембранах пластинчатого комплекса (Гольджи) при слиянии пузырьков с цистернами [252].

Актиновые филаменты в клетках слюнных желез формируют сетчатый слой под люминальной плазмалеммой и прикрепляются к zonula adherens в ацинарных клетках; каждый ПК этих клеток состоит из 1-4 (в среднем 2.8) слегка анастомозирующих КФ со случайными перерывами. Ширина пояса ПК 0.28 мкм, проницаемость его для лантана довольно высокая [468]. Ниже располагаются десмосомы (табл. XXV, в).

Во вставочных протоках ПК представлены 2-3 КФ и характеризуются умеренной проницаемостью. Эпителиоциты исчерченных протоков в околоапикальных зонах соединены развитыми ПК, представленными 5-8 анастомози-рующими КФ, практически непроницаемыми для маркеров. Базальнее расположены промежуточные контакты и десмосомы.

Между ацинарными клетками часто встречаются ЩК, однако они отсутствуют между клетками протоков. Диаметр ЩК варьирует от 0.2 до 1.2 мкм (в среднем 0.47+0.12). ЩК в подъязычной железе взрослых крыс выявляются как между гомологичными, так и между гетерологичными серозными, слизистыми и миоэпителиальными клетками и имеют необычно большую протяженность (до 1.3 мкм) [355]. В клетках концевых отделов околоушной железы крысы ЩК занимают около 1.6% площади латеральной поверхности. Обнаружена тесная связь цистерн ЦПС и ЩК. Вблизи ЩК нередко обнаруживаются митохондрии, к наружной мембране которых иногда прикрепляются филаменты, связанные с десмосомами [155]. Агрегаты ВМЧ, характерные для десмосом, найдены в ацинарных, протоковых и даже в миоэпителиальных клетках. Но они меньше по размерам и встречаются гораздо реже, чем в покровном эпителии [457].

Следовательно, ацинарные клетки могут передавать электрические сигналы как другим ацинарным клеткам, так и миоэпителиальным клеткам. Наличие ЩК между отростками миоэпителиальных клеток позволяет синхронизировать их контрактильную функцию.

Реорганизация межклеточных соединений в подчелюстной слюнной железе крысы в заключительные сроки эмбрионального и в ранние сроки постнатального развития характеризуется тем, что у плода чаще встречаются точечные ПК, тогда как типичные ПК появляются уже перед самым рождением [456].

В эпителиоцитах желудка Кр плазмалеммы приближается к 2. ПК представлены сетями анастомозирующих КФ, число которых может достигать 10 и более. КФ ветвятся и образуют ячейки неправильной формы. Обычно ПК мукоцитов слизистой желудка состоят из 5-6 КФ, а средняя глубина пояса 0.47 мкм [331 ]. Прилежащая к просвету КФ в большинстве случаев непрерывна, иногда удвоена и имеет слегка волнообразный ход. По направлению к базальной поверхности ячейки в сети КФ увеличиваются, выявляются отдельные слепо оканчивающиеся КФ, которые иногда связаны с ЩК. Изредка КФ как бы окаймляют ЩК. Обычно крупные округлые или неправильной формы ЩК располагаются на латеральной плазмалемме в зоне нахождения митохондрий.

В париетальных клетках желудка Кр мембран внутриклеточных канальцев достигает 10, PF-поверхность буквально усеяна ВМЧ. На сколах плазмалеммы обнаруживаются мелкие ВМЧ, которые на PF-поверхности образуют ортогональные группы. Подобные группы ВМЧ встречаются на базальной плазмалемме и на мембранах тубуловезикулярной системы и связаны, по-видимому, с функционированием ионных насосов [88].

Межклеточные соединения главных клеток похожи на таковые в покровном эпителии [263]. Глубина ПК 0.34 мкм. Если ПК между мукоцитами непроницаемы для лантана, то ПК между гландулоцитами его пропускают [263, 331 ].

На PF-поверхности плазмалеммы микроворсинок энтероцитов тонкой кишки обнаруживается большое количество ВМЧ. Однако на самой верхушке микроворсинки (на PF), где прикрепляются микрофиламенты, ВМЧ отсутствуют [513]. У человека и макак на боковых поверхностях микроворсинок обнаружены ВМЧ, упакованные в ряды. Частицы занимают 5% поверхности микроворсинки и имеют округлую (диаметр 8-9 нм) или палочковидную (длина 18 нм) форму [362]. По-видимому, их наличие связано с трансмембранным переносом ионов натрия.

Энтероциты соединены друг с другом с помощью ПК, промежуточных контактов, ЩК и десмосом. ПК представлены сетью из 6-12 анастомозирующих параллельных, частично извилистых КФ, полностью изолирующих просвет клеток от интерстициального пространства. Тем не менее с помощью комплементарных реплик доказано, что в 5% КФ есть перерывы, что может объяснить сравнительно низкое трансэпителиальное сопротивление в пласте, имеющем столь большое число соединительных полосок. С базальной стороны от пояса ПК нередко отходят длинные, извилистые или завитые, слепо оканчивающиеся КФ [508]. ВМЧ, располагающиеся между КФ, могут формировать нерегулярные агрегаты (табл. XXVI).

В толстой кишке ПК расположены в апикальной части эпителиальных клеток, Ширина пояса ПК и количество КФ в нем увеличиваются по мере миграции клеток от крипт к поверхности кишки. В криптах между клетками найдены отдельные изолированные свободные полоски и точечные ПК; в покровном эпителии они отсутствуют. ПК клеток ворсинок и в средней части крипт непроницаемы для лантана, а в области дна крипт пропускают лантан, введенный в просвет. Следовательно, проницаемость межклеточных контактов уменьшается по мере созревания и миграции энтероцитов [347]. На плазмалемме микроворсинок каемчатых энтероцитов обнаружены ряды ВМЧ. Наиболее характерен этот феномен для прямой кишки [362].

Отличий в структуре ЩК между ГМК различных отделов толстой кишки не обнаружено. Отмечено, что ЩК в продольных лентах наружного мышечного слоя слепой кишки не встречаются, однако между ними найдены промежуточные контакты. В кишке выявлены гетерологические ЩК (между мышечными и интерстициальными клетками [188]).

В процессе онтогенеза происходит постепенное усложнение межклеточных контактов между энтероцитами. На ранних этапах эмбриогенеза ПК состоят из 1-7 КФ и легко проницаемы для раствора лантана. В середине эмбрионального периода развития проницаемость ПК увеличивается. Это обусловлено, вероятно, событиями, связанными с реорганизацией эпителиального пласта и образованием кишечных ворсинок. В дальнейшем, вплоть до рождения, структура ПК становится все более дифференцированной, приближаясь к состоянию, свойственному зрелому животному. Вначале образуются короткие КФ, затем формируется сильно анастомозирующая сеть, ячейки которой сперва округлы и полигональны, а впоследствии могут принимать угловатую форму. ЩК в процессе эмбриогенеза также постоянно усложняются. Вначале они представлены мелкими агрегатами ВМЧ, увеличивающимися до нормальных размеров к моменту рождения [508].

В процессе позднего эмбриогенеза и ранних стадий постэмбрионального развития число ВМЧ на плазмалемме всасывающих клеток тонкой кишки не меняется вплоть до прекращения кормления молоком. Затем отмечен значительный рост количества ВМЧ, после чего число их постепенно снижается. Эти изменения хорошо коррелируют с изменениями активности ряда ферментов микроворсинок [58].

В печени количество ВМЧ на сколах плазмалеммы микроворсинок желчных канальцев, несколько выше, чем в окружающей плазмалемме, но они содержат сравнительно мало ФСД [416]. Вокруг желчных канальцев обнаруживаются ПК, состоящие из 3-8 КФ (в среднем 5.4), которые идут параллельно просвету желчного канальца. С базальной стороны ПК выявляются слепые выросты. КФ имеют волнообразный вид, слабо анастомозируют и образуют вытянутые или округлые ячейки. Перерывов в КФ не обнаружено. Совокупная длина КФ ПК на 1 мкм длины желчного канальца колеблется от 4 до 14 мкм (в среднем 7-4). Средняя ширина пояса ПК равна 0.32 мкм (табл. XXVII).

ЩК локализованы преимущественно на латеральной поверхности гепатоцитов и характеризуются разнообразием форм и размеров и относительно ровными контурами. Они занимают около 1-4% поверхности плазмалеммы гепатоцитов [417]. Их площадь в среднем составляет 0.5 мкм2. Довольно часто встречаются десмосомы.

На плазмалемме отростков липоцитов обнаруживаются кавеолы и два типа ВМЧ: мелкие и крупные. При введении витамина А отмечается перераспределение ВМЧ. Для липоцитов характерно большое количество липидных включений, многие из которых окружены мембраной, содержащей ВМЧ диаметром 7-15 нм [504].

У крысы на 14-15-е сут эмбриогенеза на плазмалемме вокруг желчных канальцев обнаруживаются скопления ВМЧ в виде линейных рядов и небольших гребней. К 21-м сут эмбриогенеза перерывы в фибриллах исчезают и сеть ПК становится полностью дифференцированной. Сходные события происходят и при регенерации печени [551].

При холестазе снижается число КФ в поясе ПК и его ширина. КФ становятся фрагментированными. Особенно значительно уменьшаются число и размеры ЩК- Кроме того, на плазмалемме начинают появляться агрегаты ВМЧ, состоящие из 10-50 частиц. Количество десмосом возрастает [417].

ПК между эпителиоцитами желчного пузыря представлены сетью анастомозирующих КФ, число которых колеблется от 5 до 11 и более.

В ацинарных клетках поджелудочной железы количество ВМЧ на сколах мембран гранул зимогена относительно мало. На латеральной плазмалемме количество ВМЧ почти на порядок выше. Следовательно, мембрана гранул отличается по своей структуре от плазмалеммы.

ПК представлены развитой сетью из 5-12 анастомозирующих КФ. Ширина пояса ПК колеблется от 0.2 до 0.5 мкм [231]. На латеральной плазмалемме в большом количестве встречаются ЩК, состоящие из агрегатов ВМЧ диаметром 12 нм. Размеры ЩК варьируют, их средняя площадь 0.5 мкм 2 (табл. X, XXV и XXVIII).

Развитие ПК в поджелудочной железе в эмбриогенезе характеризуется постепенным усложнением сети КФ. У 12-13-суточных эмбрионов мышей ПК между эпителиоцитами ацинусов образованы лишь единичными КФ. У 14-17-суточных эмбрионов фибриллы становятся более многочисленными. Показано, что как во время поздних периодов эмбриогенеза, так и в постнатальном развитии поджелудочной железы крыс и мышей ПК между ацинарными клетками заменяются на ЩК- Этот процесс характеризуется появлением ВМЧ диаметром 12-13 и 9-10 нм [252].

Между А- и В-клетками островков обнаружены ПК и ЩК [369]. Обычно в В-клетках ЩК не обязательно ассоциированы с ПК- Количество ЩК на одну клетку варьирует от нескольких единиц до многих десятков. По периферии островка большинство ЩК между В-клетками образует скопления, занимающие 35-40% поверхности плазмалеммы. По-видимому, островок функционирует как синцитий, хотя есть клетки, не вовлеченные в кооперацию - лишенные ЩК. Таким образом, распределение метаболической активности клеток в островках регулируется посредством изменения строения и распределения ЩК [325].

В процессе созревания инсулинсодержащих гранул в В-клетках происходит слияние окружающих их мембран, при этом на них происходит исчезновение ВМЧ и образование розетки слияния [369]. При обработке филипином количество ФСД в мембранах инсулиноцитов невелико. В пластинчатом комплексе (Гольджи) созревание цистерн сопровождается уменьшением числа ВМЧ и возрастанием количества ФСД [369].

8.6. ОРГАНЫ ДЫХАНИЯ

В клетках мерцательного эпителия верхних дыхательных путей Кр, плазмалеммы больше 1. Численная плотность ВМЧ на ресничке мерцательной клетки составляет ? от соответствующего параметра на обонятельной. Более того, Кр плазмалеммы обонятельных клеток бывает меньше 1. Число ожерелий ВМЧ на ресничке колеблется от 3 до 6. На апикальной плазмалемме поддерживающих эпителиальных клеток и гранулоцитов слизистых желез у крыс и собак обнаружены агрегаты ВМЧ [329]. На цилиарных клетках с большим постоянством выявляются тетра- или ортогонально упакованные агрегаты ВМЧ [200].

ПК между гландулоцитами в железах состоят из 4-8 КФ. В то же время ПК между обонятельными рецепторами, поддерживающими и реснитчатыми клетками представлены 6-11 КФ. У млекопитающих КФ обонятельных клеток состоят из дискретных частиц [329, 335]. Маленькие угловатые ЩК у крыс встречаются только на поддерживающих клетках.

В подслизистых железах надгортанника, гортани и проксимального отдела трахеи среднее число КФ ПК между серозными клетками достоверно ниже, чем между слизистыми и протоковыми клетками. Наибольшее число КФ выявлено между реснитчатыми клетками. Эти ПК непроницаемы для лантана. Между серозными и слизистыми клетками обнаружены ЩК [437].

ПК между реснитчатыми клетками в трахее состоят из 5-7 анастомозирующих КФ. В бокаловидных клетках при накоплении секрета ПК имеют вид "непроницаемых", если же клетка выделяет секрет, то их "плотность" снижается. Базальнее ПК найдено множество ЩК, которые координируют активность эпителиальных клеток и подвижность ресничек. Иногда на латеральной плазмалемме встречаются линейные агрегаты ВМЧ. На поперечных сколах апикальных зон клеток видно, что каждая ресничка окружена микроворсинками [241, 537].

В бронхах между реснитчатыми клетками ПК состоит из анастомозирующей сети непрерывных контактных фибрилл, ширина пояса ПК составляет 250 нм. Между реснитчатой и бокаловидной клеткой ПК состоит из узкой сети КФ, число которых редко превышает 4-5. Наконец, степень развития ПК между смежными бокаловидными клетками занимает промежуточное положение [318].

В целом, в эпителии воздухоносных путей выделено три типа ПК: 1) с параллельно расположенными редко анастомозирующими полосками, образующими крупные петли, 2) с большим анастомозированием, но с крупными петлями, 3) с тесным переплетением КФ.

Если в трахее реснитчатые клетки имеют ПК первого типа, то в мелких бронхах - второго и третьего типов. Щеточные клетки на всех уровнях воздухоносных путей окружены ПК второго типа, бокаловидные - ПК третьего типа, серозные - ПК второго или третьего типов, клетки Клара - ПК третьего типа. Промежуточные мало дифференцированные имеют все три типа ПК- Наибольшая длина фибрилл ПК у реснитчатых клеток бронхиол (52 мкм), трахеи (16-23 мкм) и клеток Клара (20.5 мкм), наименьшая - у бокаловидных и щеточных клеток [436].

С помощью метода ЗСТ удалось понять многие аспекты строения липидных структур суфрактанта [269]. Не имея возможности подробно анализировать этот вопрос, отметим лишь, что сферические тельца гипофазы суфрактанта по структуре аналогичны осмиофильным тельцам альвеолоцитов II типа и состоят из ламелл и связанных с ними частиц диаметром 7- 8 нм.

В легких ПК между альвеолоцитами I и II типов развиты хорошо, ширина пояса ПК 260 нм, число КФ варьирует от 2-3 до 4-10. В эндотелии ширина ПК составляет 170 нм, а количество КФ колеблется от 1-2 до 3-4 (в среднем 2-3). Они почти не анастомозируют и, как правило, идут параллельно друг другу. ПК между альвеолоцитами непроницаемы для молекулярных зондов [435]. На базолатеральных поверхностях плазмалеммы альвеолоцитов I типа обнаружены прямоугольные скопления (от 4 до 24) частиц. На люминальной плазмалемме эти скопления отсутствуют, что дает основание считать альвеолоциты I типа производными цилиарного эпителия [70, 179] (табл. XXIX).

В легком человека между альвеолоцитами и эндотелиоцитами описаны ЩК, которые располагаются на пальцевидных выростах этих клеток [68]. В процессе эмбрионального развития и на ранних стадиях постнатального онтогенеза происходит созревание описанных специализированных структур в эпителии дыхательной системы. Формирование обонятельного эпителия характеризуется постепенным усложнением ПК. Если вначале ПК представлены 1-2 КФ, то к моменту рождения они приобретают черты строения, свойственные взрослому организму. В этом процессе участвуют и ЩК, которые в дальнейшем исчезают и у взрослых не найдены.

К моменту рождения заканчивается формирование "ожерелий" на плазмалемме ресничек [95].

8.7. ОРГАНЫ ВЫДЕЛЕНИЯ

Для мембранных структур в нефронах характерна асимметрия распределения ФСК: их в 2 раза больше на экстрацеллюлярном монослое липидов [333].

Изредка на клетках париетального эпителия почечного тельца встречаются реснички, число "ожерелий" ВМЧ на которых, как правило, не превышает 3-4. Кавеолы на базальной плазмалемме часто выстроены в дискретные линейные группы. ПК должны быть отнесены к проницаемым, так как пероксидаза хрена проходит через межклеточную щель. Встречаются ЩК и десмосомы. У крыс и хомячков ЩК обнаруживаются очень редко [373].

При обработке филипином число ФСД в апикальных и базальных отделах было довольно высоким, в то время как в основании педикул они практически не встречались [372]. Если у взрослых животных лишь изредка на педикулах обнаруживаются короткие сегменты КФ, то в незрелых почечных тельцах между телами подоцитов и их педикулами находятся довольно четкие элементы КФ [373]. Фрагменты ПК появляются между подоцитами почечных телец после облитерации щелевидных пор при нефротическом синдроме и при его моделировании с помощью растворов поликатионов. ПК между педикулами во многом соответствуют замыкающим структурам в эндотелии кровеносных сосудов, поскольку ВМЧ больше связаны с наружным листком плазмалеммы [268] (табл. XI, в).

В интактных почках пространства между смежными педикулами соседних подоцитов перекрыты тонкими диафрагмами, строение которых напоминает застежку-молнию. Она состоит из фибрилл, протянутых между плазмалеммами смежных педикул. Однако щелевая диафрагма на сколе и после ГТ может выглядеть как ровная пластинка без каких-либо тонких деталей [248]. Численная плотность пор в окончатых эндотелиоцитах может достигать 70 на 1 мкм2. В процессе постнатального онтогенеза число пор на клетку постоянно возрастает [26]. Суммарное количество ВМЧ на обеих поверхностях скола плазмалеммы эндотелиоцитов, активно участвующей в метаболических процессах, довольно велико (табл. XXX).

Межэндотелиальные контакты представлены как ПК, так и довольно редко встречающимися ЩК- ПК состоят из 1-2 прерывистых полосок, которые располагаются в углублениях EF-поверхности скола и не образуют сплошной сети, часто исчезают и иногда даже образуют нечто подобное штриховой линии. ВМЧ на EF-поверхности, как правило, не сливаются, и полоски выглядят как бусоподобные структуры. На PF-поверхности скола встречаются отдельные ВМЧ и даже небольшие по длине (до 200 нм) сплошные полоски [6, 26]. ЩК невелики по размерам, число ВМЧ в них не превышает нескольких десятков.

Наиболее интересной чертой плазмалеммы мезангиальных клеток является присутствие здесь значительного числа ЩК, в том числе и между отростками тех же самых клеток (возвратные ЩК), что свидетельствует о гладкомышсчном происхождении мезангиоцитов. Соединение всех мезангиальных клеток с помощью ЩК позволяет интра- и экстрагломерулярному мезангию действовать в качестве функционально координированного синцития, участвующего в активации гранулярных клеток юкстагломерулярного аппарата [373].

В извитой части проксимальных канальцев численная плотность ВМЧ наибольшая на PF-поверхности микроворсинок и наименьшая в базальных областях плазмалеммы. В прямой части проксимального отдела нефрона микроворсинки имеют наиболее высокое содержание частиц на EF-поверхности. К плазмалеммы в извитых канальцах во всех областях плазмалеммы меньше, чем в прямых отделах. Неодинаковые размеры ВМЧ отражают преимущественное включение в плазмалемму белков, обеспечивающих различные стороны процесса реабсорбции [373].

Степень развития ПК между нефроцитами варьирует даже в пределах одной клетки. Можно обнаружить резкий переход от одной КФ к нескольким. ПК в прямой части являются более развитыми, чем в извитом отделе, хотя степень различий зависит от вида животного. Строение ПК хорошо коррелирует с низким трансэпителиальным электрическим сопротивлением в обоих сегментах проксимальных канальцев и с ролью канальца в изотонической реабсорбции фильтрующейся жидкости. В эмбриональных почках ПК представлены 1-2 прерывистыми КФ [236]. ЩК объединяют нефроциты в единый функциональный синцитий (табл. XXXI).

При обработке филипином содержание ФСД в мембранах клеток проксимальных канальцев сильно варьирует от высокой (вакуолярный аппарат) до чрезвычайно низкой (митохондрии и эндоплазматическая сеть) [195].

В нисходящем колене петли нефрона численная плотность ВМЧ на PF-поверхности всех областей плазмалеммы очень велика - наиболее высокая среди нефроцитов всех отделов. Содержание ВМЧ снижается по мере опускания петли во внутреннюю зону мозгового вещества. КФ ПК на PF-поверхности часто выглядят утолщенными за счет слияния двух полосок в одну [373].

В восходящем отделе численная плотность ВМЧ меньше, а ПК соответствуют таковым в нисходящем отделе у человека. У кролика ПК в восходящем колене менее развиты. Плазмалеммы различных сегментов петли нефрона отличаются также по содержанию холестерина [371].

Наиболее характерной чертой люминальной плазмалеммы нефроцитов дистальных канальцев является присутствие популяции вытянутых ВМЧ на PF-поверхности. Клетки, содержащие такие ВМЧ, могут быть аналогами темных клеток собирательных трубок. КФ ПК располагаются параллельно друг другу и на небольшом расстоянии друг от друга, имеют мало ветвлений. Они проницаемы для лантана, но препятствуют проникновению пероксидазы. В области плотного пятна проницаемость эпителия увеличена. Хотя между нефроцитами в плотном пятне ЩК не обнаружены, однако остальные клеточные элементы юкстагломерулярного аппарата соединены друг с другом с помощью ЩК [373].

В светлых клетках собирательных трубок численная плотность ВМЧ на люминальной PF-поверхности прогрессивно уменьшается по направлению из коркового вещества во внутреннее мозговое. Содержание ВМЧ на EF-поверхности остается постоянным. К плазмалеммы здесь наиболее низкий из всех отделов нефрона. Базолатеральная плазмалемма характеризуется ортогональным распределением ВМЧ, которые состоят из двух популяций: обычных глобулярных ВМЧ и частиц с плоской вершиной. Последние собраны в скопление с квадратной упаковкой. Агрегаты занимают до 15% поверхности мембран на базальной плазмалемме и 3% на латеральной. Эти агрегаты участвуют, по-видимому, в трансмембранном переносе веществ.

На люминальной плазмалемме агрегатов нет, однако изредка обнаруживаются скопления глобулярных частиц на EF-поверхности, что связано с изменениями водной проницаемости. При индуцированном диурезе их число возрастает [290].

Характерной чертой плазмалеммы темных клеток является наличие определенной доли удлиненных или стержневидных ВМЧ. Их процент особенно высок на люминальной PF-поверхности. Общее число ВМЧ почти одинаково в пределах всех отделов плазмалеммы. Длина палочковидных ВМЧ в 2 раза превышает диаметр обычных, а ширина у них одинаковая. Как правило, палочковидные ВМЧ присутствуют в клетках с увеличенным содержанием фермента карбоангидразы. Эти ВМЧ могут, вероятно, также участвовать в транспорте хлоридов, секреторных процессах, обмене ионов калия. Число клеток с палочковидными ВМЧ увеличивается при наличии дефицита калия в пище [493].

ПК в собирательных трубках обнаружены как между гомологичными, так и между гетерологичными клетками и характеризуются большим количеством анастомозирующих КФ с очень небольшим числом перерывов в них. Они непроницаемы для лантана.

На PF-поверхности латеральной плазмалеммы нефроцитов сосочковых протоков содержится увеличенное по сравнению с другими отделами число ВМЧ. На ней также встречаются агрегаты ВМЧ с ортогональной упаковкой. Они могут занимать на базолатеральной плазмалемме до 12% ее площади. Размеры частиц возрастают по направлению к внутреннему мозговому веществу [373].

Сопоставление структуры ПК в эпителии различных отделов нефрона с электрическим сопротивлением их стенок показывает, что, за исключением петли нефрона, сопротивление возрастает вместе с увеличением сложности ПК. В ряде случаев корреляция оказывается более сложной. В петлях нефрона ПК часто состоят только из 1-2 параллельных КФ, однако они являются непрерывными и обладают значительным электрическим сопротивлением. Следовательно, ПК с относительно малым числом параллельных КФ могут тем не менее быть эффективным барьером для парацеллюлярной ионной проницаемости. С другой стороны, эксперименты с индуцированным диурезом показали, что степень развития ПК коррелирует с проницаемостью [373].

Клетки поверхностного слоя эпителия мочевого пузыря соединены между собой ПК, которые изолируют просвет органа от интерстиция и состоят из 3-5 КФ, интенсивно анастомозирующих друг с другом и расположенных несколько отступя от края люминальной плазмалеммы, которая поэтому немного заходит на боковую поверхность.

Распределение ЩК по латеральной плазмалемме нерегулярное, а размеры их варьируют от нескольких ВМЧ до крупных (4 мкм в диаметре) агрегатов неправильной формы. ЩК чаще обнаруживаются непосредственно под ПК, они встречаются и в более базальных отделах клеток. Иногда на сколе клетки выявляется множество ЩК, иногда количество их минимально. Десмосомы особенностей не имеют.

Характерным строением отличается апикальная плазмалемма поверхностного слоя клеток. На сколе обнаруживаются агрегаты глобулярных ВМЧ с правильной гексагональной упаковкой. Расстояние между центрами ВМЧ равно 16 нм, они имеют гексагональную симметрию, канал в центре и ассоциированы с гликокаликсом, поэтому при сколе остаются на EF-поверхности. Частицы пронизывают бислой липидов насквозь и выступают с внутренней и наружной поверхностей. ВМЧ состоят из отдельных субъединиц диаметром 5 нм. 73% поверхности апикальной плазмалеммы занято бляшками, оставшаяся часть принадлежит плазмалемме обычного строения. В этих участках на PF- и EF-поверхностях ВМЧ отсутствуют. Со стороны цитоплазмы к ВМЧ прикреплены короткие филаменты, соединяющие их с идущими параллельно микрофиламентами, которые пересекают смежные бляшки. Такая конструкция делает плазмалемму очень жесткой, а промежутки между бляшками придают ей определенную эластичность. Бляшки ВМЧ на люминальной плазмалемме распространяются только до уровня ПК. Агрегаты ВМЧ имеются также на мембранах дискоидальных везикул в цитоплазме. На нефиксированных образцах они остаются при раскалывании на PF-поверхности [375].

При обработке филипином ФСД выявляются лишь на тех участках плазмалеммы, которые располагаются вне бляшек. Однако применение дигитонина показывает, что холестерин в бляшках присутствует [444].

Несколько отличается строение плазмалеммы в мочевом пузыре земноводных (табл. XXXII). На апикальной плазмалемме имеет место инвертированное распределение ВМЧ. Плотность ВМЧ больше на EF-поверхности, по-видимому, это обеспечивает низкую водную проницаемость. На плазмалемме митохондриальных клеток обнаруживается множество палочковидных ВМЧ (табл. VIII, б-г). Часто они образуют линейные агрегаты [69]. Как круглые, так и палочковидные ВМЧ не метятся лектинами, за исключением лектина завязи пшеницы, который на нефиксированных препаратах вызывает агрегацию ВМЧ на EF-поверхности, соответствующую перераспределению золотой метки [102, 129].

При стимулировании осмотического потока через стенку пузыря с помощью АДГ ВМЧ при сколе апикальной мембраны чаще остаются на PF-поверхности. При этом суммарное количество ВМЧ увеличивается на 30% [13, 19, 534] (табл. VIII, а). Агрегаты отсутствуют на базолатеральной плазмалемме гранулярных клеток. Они не обнаруживаются на плазмалемме митохондриальных и гранулярных клеток и после их стимуляции АДГ. Интересно, что они не возникают, если вазопрессин действует со стороны слизистой оболочки. Число агрегатов и занятая ими площадь плазмалеммы прямо пропорциональны величине потока воды [534].

8.8. МУЖСКАЯ ПОЛОВАЯ СИСТЕМА

В семенниках на сколах базолатеральных плазмалемм поддерживающих клеток (Сертоли) видны хорошо развитые ПК. Они представлены переплетающимися тяжами дискретных или сливающихся ВМЧ. Контактные фибриллы, расположенные наиболее базально, идут параллельно друг другу и базальной мембране с интервалом 300 нм, иногда сближаясь друг с другом. Как на нефиксированных, так и на фиксированных образцах ПК состоят из рядов ВМЧ, расположенных на углублениях EF-поверхности. Количество КФ может доходить до 40 и более на одну клетку. Они расположены по всему периметру на уровне ядра. Иногда соседние КФ соединены рядами ВМЧ. По соседству с ПК расположены ЩК, имеющие атипичное полиморфное строение. ПК между поддерживающими клетками чрезвычайно устойчивы к действию гипертонических растворов [193].

В семенниках собак (в меньшей степени человека) базальнее ПК найдены септированные контакты, которые выглядят как двойные параллельные ряды дискретных или слившихся ВМЧ. Расстояние между рядами в паре 10 нм, а между парами 20-70 нм [115, 133]. Септированные соединения обнаружены также между клетками Сертоли и созревающими сперматозоидами, когда в последних остается уже гаплоидный набор хромосом [133].

ПК между поддерживающими клетками надежно предупреждают попадание интерстициальной жидкости в просвет семенного канальца, где микроокружение высокоспецифично, и в обратном направлении - антигенов сперматозоидов в интерстиций. Во время прохождения половых клеток из базального отдела канальца к люминальному отмечается локальная дезорганизация и распад специализированных контактов.

ЩК между поддерживающими и половыми клетками малы и относительно редки. На базальной плазмалемме найдены гемидесмосомы, а на латеральной иногда обнаруживаются рудиментарные десмосомы. Интерстициальные клетки соединены между собой с помощью ЩК [114, 133, 354].

Сразу после рождения ПК между клетками Сертоли практически отсутствуют, но хорошо развиты ЩК- По мере созревания животных количество ЩК уменьшается, а ПК становятся более выраженными. После достижения половой зрелости феминизация животного не влияет на строение межклеточных контактов [354].

В выносящих канальцах яичка ПК между нереснитчатыми клетками, а также между ними и реснитчатыми, развиты слабо. Имеющиеся здесь ЩК часто связаны с фрагментированными ПК [500].

На плазмалемме ресничек главных призматических клеток канальцев придатка яичка количество ВМЧ относительно невелико. ПК между клетками развиты хорошо, однако по ходу КФ встречаются перерывы. Напротив, апикальная плазмалемма светлых нереснитчатых клеток канальцев придатка содержит увеличенное число ВМЧ [100, 207]. Между эпителиальными клетками семявыносящего протока имеются хорошо развитые ПК, которые дополняются дискретными КФ, разбросанными по остальной поверхности латеральной плазмалеммы. Ширина пояса ПК достигает 0.6-0.7 мкм. Между клетками описаны ЩК диаметром 20-700 нм [354].

Строение мембран сперматозоидов характеризуется чрезвычайной сложностью и значительной видовой специфичностью. Для плазмалеммы сперматозоидов обезьян характерно гомогенное распределение ВМЧ размером 7-8 нм на всем протяжении головки, среднего и главного отделов хвоста. На периферическом листке акросомальной мембраны сперматозоидов могут наблюдаться (только при взятии их из придатка яичка) тетрагональные скопления ВМЧ. У экваториальной бороздки ВМЧ образуют линейные ряды. Диаметр ВМЧ плазмалеммы головки у сперматозоидов человека варьирует от 10.5 до 13.4 нм. Агрегаты возникают редко. На ядерной оболочке отчетливо прослеживается гексагональное расположение пор [409].

По мере продвижения сперматозоидов по канальцам придатка в их акросомальной мембране может происходить распад гексагональной упаковки ВМЧ и появление линейной [501].

Наиболее общей чертой изменений мембран во время акросомальной реакции является снижение содержания ВМЧ (очищение) на уровне экваториального сегмента, а в области акросомы - агрегация ВМЧ. При оплодотворении микроворсинки ооцита предпочтительно вступают в контакт с теми участками плазмалеммы, где сконцентрированы ВМЧ, а слияние с плазмалеммой ооцита происходит в упомянутой выше экваториальной области сперматозоида [338].

В ацинусах между эпителиальными клетками предстательной железы встречаются типичные ПК, имеющие признаки, которые позволяют отнести их к непроницаемым (большое число анастомозирующих и параллельных КФ, не имеющих перерывов [473]). При действии факторов, благоприятствующих образованию ПК, последние могут формироваться в атипичном положении: выше обычного расположения и в базальных отделах клетки [257]. ЩК между эпителиоцитами довольно редки.

8.9. ЖЕНСКАЯ ПОЛОВАЯ СИСТЕМА

Между эпителиальными клетками поверхностного эпителия яичника обнаружены типичные ПК, ЩК и десмосомы. ПК чаще всего неполные, пространственно связанные с ЩК. Это обусловлено особыми свойствами эпителия, подвергающегося разрыву во время овуляции [413]. В яйцеклетке оолеммы Кр>1. В оолемме обнаружены особые ромбовидные скопления ВМЧ, о функции которых практически ничего не известно [519].

Между отростками фолликулярных клеток и плазмалеммой микроворсинок ооцитов обнаружены ЩК. Размеры их невелики (иногда всего 5-30 коннексонов), но они чрезвычайно многочисленны (следует отметить, что ЩК между онтогенетически различными клетками в организме млекопитающих вообще встречаются редко). Закладываются они очень рано. Этому предшествуют расширение и быстрая дифференцировка ЩК между клетками зернистой зоны. Все это свидетельствует о том, что фолликулярные клетки регулируют процесс созревания ооцитов посредством посылки сигналов в ооцит через ЩК. ЩК найдены и между другими клетками фолликула [53].

Строение ЩК между гомологичными клетками (клетками зернистой зоны и сосудистого слоя) и гетерологичными клетками (ооцитами и фолликулярными клетками) не меняется при падении концентрации в крови гонадотропина и стероидных гормонов. Однако введение этих гормонов приводит к увеличению количества ЩК- Во время беременности число ЩК между лютеиновыми клетками также увеличивается. Доказано, что редукция ЩК между клетками зернистой зоны перед овуляцией обусловлена их эндоцитозом и имеет непосредственное отношение к выбросу ооцита.

В децидуальных клетках, образующихся в конце беременности, найдены "возвратные" ЩК [111, 295].

Уже в зачатках гонад встречаются ПК, которые после врастания половых шнуров сохраняются лишь в поверхностном эпителии. ЩК в примордиальных фолликулах обнаруживаются перед рождением и в дальнейшем появляются между всеми клетками фолликула. Поверхностный эпителий после рождения имеет слаборазвитые, проницаемые ПК, что приводит к тому, что многие ооциты примордиальных фолликулов в раннем постнатальном онтогенезе выбрасываются в брюшную полость [145, 336].

Эпителиальные клетки, выстилающие внутреннюю поверхность яйцевода, соединены ПК. Между секреторными клетками ПК представлены 5-14 КФ, образующими пояс глубиной 0.3-1.0 мкм, который характеризуется неправильной ориентацией фибрилл и хорошо развитыми анастомозами между ними. ПК, соединящие мерцательные клетки, распространяются на глубину 0.3- 1.1 мкм и состоят из 4-14 КФ, расположенных параллельно друг другу с интервалом 40 нм. Строение ПК между секреторными и мерцательными клетками аналогично таковому между реснитчатыми клетками. Все эти контакты относятся к категории непроницаемых. В среднем число КФ на сколах составляет 5.3╠1.6, а ширина пояса 0.51 ╠0.20 мкм на один ПК Такое строение ПК может иметь также существенное значение в предупреждении повреждений клеток при мерцании ресничек. Структура ПК зависит от фазы менструального цикла и обусловлена изменением соотношения клеток различного вида [516].

После обработки филипином обнаруживается высокое содержание ФСД на плазмалемме и на мембране секреторных гранул. ФСД, однако, отсутствовали в области шейки реснички [317].

В матке мембраны эпителиоцитов эндометрия имеют обычное строение, характерное для эпителиальных тканей: высокий Кр, большое содержание ВМЧ. На ресничках видны "ожерелья" ВМЧ. ПК представляют из себя анастомозирующую сеть КФ, в пределах ячеек которой видны ЩК, состоящие из 10-25 сгруппированных коннексонов [352].

Строение мембран меняется в зависимости от времени менструального цикла. В матке человека на 14-16-е сут цикла ПК имеют ширину пояса 0.43 мкм ╠0.09 мкм и состоят из 4-5 КФ. На 24-25-е сут менструального цикла ширина пояса ПК существенно уменьшается, до 0.21 мкм╠0.10 мкм. ПК в этот период состоят из 1-4 КФ, имеющих неправильный ход. Следовательно, в середине менструального цикла состав маточного содержимого регулируется более точно, чем в другие фазы цикла, что имеет важное значение для имплантации зародыша [353]. В период имплантации в апикальной плазмалемме эпителиоцитов увеличивается содержание холестерина [351].

В ответ на появление в полости матки бластоцисты происходит резкое увеличение числа ЩК между клетками. Это особенно четко определяется при образовании имплантационной камеры. Обнаруживаются как вставочные ЩК (в пределах пояса ПК), так и более крупные ЩК в нижних участках латеральной плазмалеммы [545]. Межклеточное сообщение посредством ЩК является одним из первых показателей узнавания зародыша маточным эпителием к началу имплантации. У крыс в день имплантации (5-е сут беременности) протяженность и густота сети КФ ПК увеличивалась в 3 раза по сравнению с величиной, наблюдаемой в 1-е сут [353].

У кроликов во время беременности происходит резкая пролиферация зоны ПК и развитие точечных ПК [546]. Беременность инициирует формирование между эпителиоцитами ЩК, что также является подготовительной ступенью к образованию клеточных симпластов [103].

После родов строение мембран эпителиальных клеток эндометрия довольно быстро восстанавливается [242]. Перед родами в миометрии нарастает число ЩК, что обеспечивает эффективную синхронизацию сокращений ГМК в родах [191, 240]. То же происходит у беременных животных и после удаления яичников, что вызывает аборт или резорбцию плода. Причиной является падение содержания прогестерона в крови. После родов количество ЩК уменьшается [242].

Между эпителиальными клетками молочной железы обнаружены ПК, расположенные в апикальной части латеральной плазмалеммы, и ЩК, локализованными ниже ПК. ПК образованы 5-8 КФ с хорошо развитыми анастомозами. В нелактирующей молочной железе люминальная КФ обычно ровная, не имеющая перерывов. Базальная КФ часто образует короткие и длинные слепые ответвления по направлению к основанию клетки. Изредка встречаются клетки, где ПК представлены лишь двумя контактными полосками. ЩК имеют диаметр 0.3-1.0 мкм и характеризуются обычным строением. Редко встречаются ЩК диаметром 3 мкм. Единичные клетки содержат множественные ЩК [244, 395].

Эпителиальные клетки выводных протоков молочной железы также соединены ПК, ЩК, десмосомами и промежуточными контактами. Десмосомы и ЩК соединяют между собой ацинарные, протоковые и миоэпителиальные клетки.

После начала секреции альвеолоциты теряют большинство десмосом и промежуточных контактов, однако ПК и ЩК сохраняются. Сеть КФ в ПК становится упорядоченной.

В интенсивно лактирующих молочных железах ПК около ворсинчатой апикальной части состоят из 6-8 КФ. Ячейки сети приобретают веретеновидную форму у люминальной стороны и более округлую на базальной стороне [395].

Исследование плаценты человека гемохориального типа с помощью метода ЗСТ не дало принципиально новой информации о строении мембран различных компонентов плацентарного барьера. Плазмалемма редко встречающихся клеток цитотрофобласта имеет характерные вдавления [131]. В ПК между клетками трофобласта мыши встречаются перерывы в КФ, что приводит к снижению их барьерной функции. В межклеточных щелях обнаружены плохо идентифицирующиеся на репликах десмосомы и ЩК- Последние отличаются обилием и вариабельностью размеров и формы [56]. В большом количестве ЩК различной формы обнаружены между клетками различных слоев гематохориального барьера крысы. Они занимают значительную долю плазмалеммы. Как правило, в областях, где локализованы ЩК, плазмалемма не имеет признаков пиноцитозной активности [172].

* * *

Таким образом, приведенные данные показывают, что основные закономерности строения мембран клеток в различных органах уже установлены. Продолжается интенсивный набор новых фактов по изменению внутренней организации клеточных мембран в условиях патологии, эксперимента, индивидуального развития.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Метод ЗСТ, введенный в практику биологических исследований для анализа и исключения артефактов, присущих рутинным методам электронной микроскопии, использующих химическую фиксацию, стал вполне самостоятельным методом, который позволяет получать принципиально новую информацию о структуре исследуемых объектов. Наиболее широкое применение этот метод получил при анализе структуры внутриклеточных и плазматических мембран и их специализированных участков. Кроме того, различные вариации этого метода позволяют решать и другие проблемы гисто- и цитофизиологии.

Представленный в книге материал показывает, что в настоящее время уже собраны первичные сведения о внутреннем строении самых разнообразных мембранных структур в пределах различных тканей и органов. Получены морфологические обоснования для ряда функциональных феноменов. Началось интенсивное изучение морфологических коррелятов различных клеточных функций, развернут широкий фронт исследований перестроек мембран различных клеток и тканей в ходе эмбрионального развития и постнатального морфогенеза, при старении, при различных экспериментальных и патогенных воздействиях, при регенерации и т. д.

Задача настоящего этапа развития интермембранной морфологии в углублении и уточнении сложившихся представлений, внедрении новых модификаций метода ЗСТ с целью получения дополнительной информации, расширении спектра применения этого метода для исследования патологических состояний и заболеваний (включая анализ биопсийного материала), прогнозирования дальнейшего течения заболеваний и суждения об их истинной причине. В настоящее время уже получены практически важные результаты при исследовании этим методом эритроцитов у больных артериальной гипертензией, при изучении мембран миоцитов у людей с мышечными дистрофиями. Особенно важную информацию можно получить при комбинации гистохимических, иммунологических и авторадиографических методов с физическими методами препарирования объектов.

Что касается самого метода ЗСТ, то здесь по-прежнему в центре внимания остается проблема артефактов. Тщательный контроль всех этапов процедуры подготовки образцов, широкое использование метода комплементарных реплик, параллельный анализ другими методами электронной микроскопии - вот тот путь, который, по нашему мнению, позволит в значительной мере избежать неверных трактовок и суждений.

Совершенствование метода ЗСТ должно быть направлено на его адаптацию для исследования не только мембранных, но и фибриллярных клеточных и неклеточных структур, что существенно повысит его информативность и даст возможность решать новые проблемы. Разработка нетрадиционных и комбинированных методов исследования также является одним из важных путей развития этого направления. Наконец, хотелось бы отдельно вычленить и задачи, стоящие перед отечественными учеными. Во "Введении" мы уже отмечали чрезвычайно слабое развитие и ограниченное применение физических методов препарирования, использующих криофиксацию. Отставание прогрессирует прежде всего в связи с отсутствием соответствующей отечественной аппаратурной базы. Хотелось бы надеяться, что появление данной книги позволит сдвинуть эти вопросы с мертвой точки.

Мы думаем, что читатель не будет судить нас слишком строго за те недостатки, которые неизбежны при написании подобного обзорного труда. Мы не могли в сравнительно небольшой по объему книге осветить все новые факты, которые внес в цитологию и гистологию метод ЗСТ. Главной задачей было продемонстрировать возможности метода, привлечь внимание ученых-морфологов к неблагополучному положению дел с методической базой в советской морфологии. Мы сознательно опустили многие разделы гистологии и эмбриологии, в развитие которых внесено много нового с помощью метода ЗСТ. Это обусловлено, с одной стороны, тем, что в рамках ограниченного объема нельзя "объять необъятное", а с другой стороны, мы сознательно акцентировали внимание прежде всего на тех проблемах, которые имеют прямое или косвенное отношение к гистологии человека. Поэтому выпущенными из поля зрения оказались вопросы, касающиеся мембранологии растительных и бактериальных клеток, клеток беспозвоночных и некоторых низших позвоночных. Мы считаем, что это задача для специалистов соответствующего профиля, у которых, как мы надеемся, после выхода настоящей работы появится безотлагательное желание восполнить указанные пробелы. Кроме того, мы учитывали, что многие разделы интрамембранной бактериологии были ранее освещены в отечественной литературе.

Подводя итог, хотелось бы еще раз выразить надежду на то, что у читателя возник интерес к физическим методам препарирования объектов, включающим криофиксацию, и он будет пытаться применить их в своей работе.


ЛИТЕРАТУРА

-- Алимов Г. А., Банин В. В. Криофрактографический анализ принципов организации межклеточных контактов // Всесоюз. симп. "Криогенные методы в электронной микроскопии" : Тез. докл. Пущино, 1985. С. 46-47.

-- Алимов Г. А., Миронов В. А., Миронов А. А., Банин В. В. Пути трансэндотелиального транспорта по данным криофрактографиии // Всесоюз. симп. "Криогенные методы в электронной микроскопии" : Тез. докл. Пущино, 1985. С. 39-40.

-- Бакеева Л. Е., Шевелев А. А., Чепцов Ю. С, Скулачев В. П. Изучение структуры межмитохондриальных контактов кардиомиоцитов крысы методом замораживания-скалывания // Биол. мембраны. 1985. N 2. С. 133-143.

-- Беркинблит М. Б., Божкова В. П., Бойцова Л. Ю. и др. Высокопроницаемые контактные мембраны. М., 1981. 466 с.

-- Боровягин В. Л. Методы ультратонких срезов, негативного контраста и криоскалывания в исследованиях ультраструктурной организации модельных и клеточных мембран // Успехи соврем, биологии. 1974. N 3. С. 399- 421.

-- Караганов Я. Л., Алимов Г. А., Миронов В. А., Миронов А. А. Криофрактография эндотелия микрососудов // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983. N 6. С. 5-24.

-- Караганов Я. Л., Луцик М. Д., Миронов В. А., Миронов А. А. Меченые лектины в изучении клеточной поверхности // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1986. N 3. С. 83-94.

-- Караганов Я. Л., Миронов А. А., Миронов В. А. Неионогенные детергенты в изучении ультраструктуры клеток // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983. N 12. С. 5-27.

-- Карелина N. Р., Алимов Г. А., Камышева В. В. и др. Современные методы электронно-микроскопического исследования в морфологии. Л., 1986. 95 с.

-- Кевер Л. В. Выявление холестериновых доменов на срезах и сколах шванновских клеток, инкубированных в растворах филипина или дигитонина // Всесоюз. симп. "Криогенные методы в электронной микроскопии" : Тез. докл. Пущино, 1985. С. 21-23.

-- Кириллов В. А., Вотяков В. И., Конев С. В. Изучение процесса АТФ-истощения эритроцитов человека с помощью метода криоскалывания // Цитология. 1987. Т. 29, N П. С. 1245-1249.

-- Кириллов В. А., Конев С. В. Изменение ориентации плоскости скола клеточных мембран при использовании метода замораживания-скалывания как показатель изменения структуры мембран // Цитология. 1984. Т. 26, N 5. С. 520-524.

-- Комиссарчик Я. Ю. Структурные характеристики плазматической мембраны эпителиальных клеток в норме и при стимуляции водного транспорта по данным метода замораживания-скалывания // Всесоюз. симп. "Криогенные методы в электронной микроскопии" : Тез. докл. Пущино, 1985. С. 15- 18.

-- Комиссарчик Я. Ю., Левин С. В. Примембранные структуры клеток животных (структурная и химическая организация толстых мембран) // Цитология. 1974. Т. 16, N 5. С. 528-544.

-- Комиссарчик Я. Ю., Наточин Ю. В., Снигиревская Е. С, Винниченко Л. Н. Роль кальция в структурной и функциональной целостности плотного контакта эпителия мочевого пузыря лягушки // Молекулярные основы структуры и функциональной активности клетки. Л., 1978. С. 78-81.

-- Комиссарчик Я. Ю., Романов В. И., Булычев А. Г. и др. Ультраструктура мембран зон сегрегации новокаина в ядерных эритроцитах // Докл. АН СССР. 1984. N 1. С. 223-225.

-- Комиссарчик Я. Ю., Снигиревская Е. С, Винниченко Л. Н., Ивановская Е. Г. Роль катионов и поверхностных мембранных протеидов в адгезии паренхимных клеток печени крысы. 1. Влияние различных сроков перфузии на структуру клеточных контактов // Цитология. 1975. Т. 17, N 1. С. 35-40.

-- Комиссарчик Я. Ю., Снигиревская Е. С, Винниченко Л. Н., Ивановская Е. Г. Роль катионов и поверхностных мембранных протеидов в адгезии паренхимных клеток печени крысы. 2. Влияние ионов кальция на структуру клеточных контактов // Цитология. 1976. Т. 18, N 5. С. 575-579.

-- Комиссарчик Я. Ю., Снигиревская Е. С, Романов В. И., Сабинин Г. В. Анализ ультраструктурных изменений апикальной мембраны гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки при стимулированном антидиуретическим гормоном осмотическом потоке воды // Биомембраны. 1985. N 6. С. 630-641.

-- Комиссарчик Я. Ю., Филатов С. Е. Упрощенная установка для препарирования электронно-микроскопических объектов методом замораживания-травления // Цитология. 1973. Т. 15, N 12. С. 1539-1542.

-- Конев С. В., Мажуль В. М. Межклеточные контакты. Минск, 1977. 312 с.

-- Королев Е. В., Кевер Л. В. Распределение внутримембранных частиц на мембранах миелиновых оболочек аксонов центральной, периферической и вегетативной нервных систем лягушки // Всесоюз. симп. "Криогенные методы в электронной микроскопии": Тез. докл. Пущино, 1985. С. 18-21.

-- Миронов А. А. Функциональная морфология артериального эндотелия в норме и при хронической гипертензии : Автореф. дис. . . . д-ра мед. наук. М., 1985. 36 с.

-- Миронов А. А., Миронов В. А. Пространственная организация трансэндотелиальных путей гемоциркуляции в жизненно важных органах // Механизмы поддержания гомеостаза в системе микроциркуляции. М., 1981. С. 175-179.

-- Миронов В. А. Структурная организация путей гемато-перитонеального транспорта в сальнике в норме и при повышении венозного давления : Автореф. дис. . . . канд. мед. наук. М., 1980. 25 с.

-- Миронов В. А., Миронов А. А. Криофрактографическое исследование ультраструктурных изменений эндотелиоцитов перитубулярных кровеносных капилляров почки белых крыс в постнатальном онтогенезе // Онтогенез. 1984. N 4. С. 399-405.

-- Миронов В. А., Миронов А. А. Возрастные особенности морфологии сосудистого эндотелия // IX нац. конгр. по анатомии, гистологии и эмбриологии с международным участием : Резюме по докл. Плевен (НРБ), 1985. С. 59.

-- Наточин Ю. В. Ионорегулирующая функция почки. Л., 1976. 320 с.

-- Погорелое Ю. В., Миронов В. А., Миронов А. А. О тканевой принадлежности сосудистого эндотелия // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1986. N 4. С. 80-88.

-- Подлубная 3. А. Криогенные методы при изучении структуры мышц // Всесоюз. симп. "Криогенные методы в электронной микроскопии" : Тез. докл. Пущино, 1985. С. 3-7.

-- Попов В. И., Аллахвердов Б. Л. Ультраструктурный анализ роли цитоскелета в регуляции функций плазматических мембран. F-актинмембранные взаимодействия // Всесоюз. симп. "Криогенные методы в электронной микроскопии" : Тез. докл. Пущино, 1985. С. 8-15.

-- Постов Ю. В., Орлов С. И. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран. М., 1987. 188 с.

-- Потемкин В. В., Бологое Б. Д., Машков Д. И. Изучение методом замораживания-скалывания внутренней структуры идентифицированных нейронов // Всесоюз. симп. "Криогенные методы в электронной микроскопии" : Тез. докл. Пущино, 1985. С. 37-39.

-- 34. Снигиревская Е. С. Септированные контакты в сизигии Gregarina polymorpha // Докл. АН СССР. 1974. N 5. С. 1187-1188.

-- Снигиревская Е. С, Комиссарчик Я. Ю. Ультраструктура специализированных межклеточных контактов // Цитология. 1980. Т. 22. N 8. С. 1011 - 1036.

-- Снигиревская Е. С, Потапова Т. В., Комиссарчик Я. Ю., Чайлахян Л. М. Ультраструктура специализированных межклеточных контактов в культуре L-клеток, обработанных низкими концентрациями лантана // Цитология. 1979. Т. 21, N 7. С. 882- 887.

-- Сорокин А. Б., Романов В. И., Комиссарчик Я- Ю., Никольский Н. Н. Иммуноцито-химический анализ локализации рецепторов эпидермального фактора роста на плазматической мембране клеток А-431 // Докл. АН СССР. 1988. N 1. С. 15-21.

-- Фихте Б. А., Заичкин Э. И., Ратнер Е. Н. Новые методы физического препарирования биологических объектов для электронно-микроскопического исследования. М., 1973. 150 с.

-- Abbas А. К., Ault К. A., Karnovsky М. /., Unaue Е. R. Non-random distribution of surface immunoglobulin on murine B-lymphocytes // J. Immunol. 1975. Vol. 114. P. 1197- 1204.

-- Abraham M., Sandri C, Akert K. Freezeetch study of the teleostean pituittary // Cell Tissue Res. 1979. Vol. 199. P. 397-407.

-- Abachi E., Nakatani Т., Hashimoto P. H. A new technique for.obtaining large platinum-carbon replicas / /J. Microsc. (Gr. Brit.). 1987. Vol. 147. P. 205-208.

-- Adler K. Pat. 209522 (DDR). Verfahren und Vorrichtung zur Reingung von Gefrieraetz-Replikaten. Publ. Berlin, 9.05.84.

-- Adler K. Characterization of liposomes by scanning electron microscopy and freeze- fracture technique // Micron microsc. acta. 1985. Vol. 16. P. 109-113.

-- Aertgeerts R., De Maziere A. M. G. L., Scheuermann D. W. Gap junctional reorganization hypoxic rat heart // Anat. Anz. 1986. Vol. 2. P. 541-542.

-- Akert К., Livingston R. В., Moor H., Streit R. Ultrastructure of synapses in the working state. A laboratory report on recent advances // J. Neural Transm. 1974. Vol. 35. Suppl. H. 11. P. 1 - 11.

-- Akester A. R. Intercalated discs, nexuses, sarcoplasmic reticulum and transitional cells in the heart of adult domestic fowl (Gallus domesticus) // J. Anat. 1981. Vol. 133. P. 161 - 179.

-- Akiba Т., Wakabayashi T. Freeze-fracture, deep-etch of the skeletal muscle I-band region: structures corresponding to N 1- and N 2-li-nes //J. Electron Microsc. 1986. Vol. 35. P. 3105-3106.

-- Akisaka Т., Oda M. Faste buds in the vallate papillae of the rat studied with freeze-fracture preparation // Arch. Histol. Jap. 1978. Vol. 41. P. 87-98.

-- Allison D. P., Daw C. S., Porvik M. C. The construction and operation of a simple inexpensive slam freezing device for electron microscopy // J. Microsc. (Gr. Brit.). 1987. Vol. 147. P. 103-108.

-- Allt G. Ultrastructure of the silenced synapse // Trends Neurosci. 1980. Vol. 3. P. 209- 213.

-- Amanuma K., Kanaseki Т., Ikeuchi Y. et al. Studies on fine structure and location of lipids in quick-freeze replicas of atherosclerotic aorta of WHHL rabbits // Virchows Arch. A. 1986. Vol. 410. P. 231-238.

-- Amenda L. M., Blanchette-Mackie E. J., Scow R. O. Demonstration of fatty acid domains in membranes produced by lipolysis in mouse adipose tissue. A freeze-fracture study // Cell Tissue Res. 1986. Vol. 246. P. 495-508.

-- Anderson E., Albertlni D. F. Gap junctions between the oocyte companion follicle cells in the mammalian ovary //J. Cell Biol. 1976. Vol. 71. P. 680-686.

-- Appleyard S. Т., Witkowski J. A., Ripley B. D. el al. A novel procedure for pattern analysis of features present on freeze-fractu-red plasma membranes // J. Cell Sci. 1985. Vol. 74. P. 105-117.

-- Arancia G., Rosati F., Frovalusci P., De Simone C. Density and size distributions of the intramembranous particles in the cytoplasmic membrane of human peripheral blood lymphocytes. 2. Ultrastructural differences between T and В cells // Europ. J. Cell Biol. 1983. Vol. 31. P. 62-70.

-- Arguello C, Martinez-Palomo A. Freeze-fracture morphology of gap junction in the trophoblast of the mouse embryo //J. Ultra-struct. Res. 1975. Vol. 53. P. 271-283.

-- Arima Т., Shibata V., Yamamoto T. A deep-etching study of the guinea pig tracheal cilium with special reference to the ciliary transitional region // J. Ultrastruct. Res. 1984. Vol. 89. P. 31-41.

-- Arima Т., Yamamoto T. A freeze-fracture study of perinatal changes of absorptive ceils in mouse small intestine // Cell Tissue Res. 1983. Vol. 233. P. 549-561.

-- Arima Т., Yamamoto Т., Masuda H., Uemura T. Freeze-etch visualizations of some elements in the stria vascularis // Acta Otolaryngol. 1986. Vol. 26. P. 133-136.

-- Azarnia R., Loewenstein W. R. Intercellular communication and tissue growth. 7. A. cancer cell strain with retarded formation of permeable membrane junction and reduced exchange of a 330 Dalton molecule //J. Membrane Biol. 1976. Vol. 30. P. 175-186.

-- Bachi Т., Schnebli H. P. Reactions of lectins with human erythrocytes. 2. Mapping of Con A receptors by freeze-etching electron microscopy // Exp. Cell Res. 1975. Vol. 91. P. 285- 294.

-- Bachi Т., Whiting K., Tanner M. J. A. et al. Freeze-fracture electron microscopy of human erythrocytes locking the major membrane sialoglycoprotein // Biochim. biophys. acta. 1977. Vol. 464. P. 635-639.

-- Bagger-Sjoback D., Galley R. L. Synaptic structures in the type II hair cell in the vestibular system of the guinea pig. A freezefracture and ТЕМ study // Acta otolaryngol. 1979. Vol. 88. P. 401-411.

-- Bagger-Sjoback D., Rask-Andersen H. The permeability barrier of the endolymphatic sac. A hypothesis of fluid and electrolyte exchange based on freeze fracturing // Amer. J. otolaryngol. 1986. Vol. 7. P. 134-140.

-- Baker T. S., Sosinsky С. E., Caspar D. L. et al. Gap junctions structures. 7. Analysis of connexon images obtained with cationic and anionic negative stains // J. Mol. Biol. 1985. Vol. 184. P. 81-98.

-- Baradi A. F., Ryans D. G. Mesothelial intercellular junctions and pathways. A preliminary freezeetch report // Cell Tissue Res. 1976. Vol. 173. P. 133-138.

-- Baratt D., De Gol S., Sharon J. F. et al. Isolation and incorporation into lipid vesicles of a concanavalin A receptor from human erythrocytes // Biochim. biophys. acta. 1977. Vol. 465. P. 191 - 197.

-- Bartels H. Freeze-fracture demonstration of communicating junctions between interstitial cells of the pulmonary interalveolar septa // Amer. J. Anat. 1979. Vol. 155. P. 125-129.

-- Bartels H. Assemblies of linear arrays of particles in the apical plasma membrane of mitochondria-rich cells in the gill epithelium of the atlantic Hagfish (Myxine glutiuosa) // Anat. Rec. 1985. Vol. 211. P. 229-238.

-- Bartels H., Mirogall F. Orthogonal arrays of particles in the plasma membrane of pneumo-cytes // J. Submicrosc. Cytol. 1986. Vol. 18. P. 637-646.

-- Bearer E. L., Friend D. S. Modification of anion-lipid domains preceding membrane fusion in guinea pig sperm // J. Cell Biol. 1982. Vol. 92. P. 604-615.

-- Bearer E. L., Orci L. Endothelial fenestrial diaphragms a quick freeze, deep-etch study // J. Cell Biol. 1985. Vol. 100. P. 418-428.

-- Behnke O., Tranum-Jensen J., Van Dears B. Fillipin as a cholesterol probe //J. Ultrastruct. Res. 1984. Vol. 88. P. 293-294.

-- Betton J. C, Michaeli D., Fudenberg H. H. Freeze-etch study of collagen. 1. Native collagen from tendon and lung of rats // Arth-rithis Rheum. 1975. Vol. 18. P. 443-450.

-- Benedetti E. L., Emmelot P. Electron microscope observations on negatively stained plasma membrane isolation from rat liver // J. Cell Biol. 1965. Vol. 26. P. 299-305.

-- Benson A. A. On the orientation of lipids in chloroplast and cell membrane // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1965. Vol. 43. P. 265-270.

-- Bent]eld-Barker M. E., Bainton D. F. Ultra-structure of rat megakaryocytes after prolonged thrombocytopenia //J. Ultrastruct. Res. 1977. Vol. 61. P. 201-214.

-- Berggren D., Bagger-Sjoback D., Auniko M. Formation of junctional complexes in oocytes developed in vitro. A freeze-fracture study // Acta anat. 1987. Vol. 104. P. 146-152.

-- Bishop M. A. Evidence for tight junctions between odontoblasts in the rat incisor // Cell Tissue Res. 1985. Vol. 239. P. 137-140.

-- Black J. A., Foster R. E., Waxman S. G. Freeze-fracture ultrastructure of developing and adult non-myelinated ganglion cell axolemma in the retinal nerve fiber layer // J. Neurocytol. 1983. Vol. 12. P. 201-212.

-- Black J. A., Waxman S. G., Sims T. J., Gli-more C. A. Effects of delayed myelination by oligodendrocytes and Schwann cells on the macromolecular structure of axonal membrane in rat spinal cord // J. Neurocytol. 1986. Vol. 15. P. 745-761.

-- Blanchard С. E., Mackenzie M. L., Sikri K., Allt G. Filipin-sterol complexes at nodes of Ranvier // J. Neurocytol. 1985. Vol. 14. P. 1053-1062.

-- Blanchard С. E., Sikri K., Allt G. Filipin-sterol complexes at Schmidt-Lanterman incisures // Acta neuropathol. 1987. Vol. 72. P. 355-361.

-- Blaurock A. E. Bacteriorhodopsin: a transmembrane pump containing-helix // J. Mol. Biol. 1975. Vol. 93. P. 139-158.

-- Blosie F. R., Dewey M. M., Blaurock A. E., Warthington C. R. Electron microscope and low-angle X-ray retina of the frog //J. Mol. Biol. 1965. Vol. 14. P. 143-160.

-- Bohler S. Artefacts and specimen preparation faults in freeze-etch technology. Lichtenstein, 1975. 60 p.

-- Boonstra J., van Balzen N., van Mauzik P. et al. Immunocytochemical demonstration of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryomicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture // J. Microsc. (Gr. Brit.) 1985. Vol. 140. P. 119- 129.

-- Bordi C., Perrelet A. Orthogonal arrays of particles in plasma membranes of the gastric parietal cell // Anat. Rec. 1978. Vol. 192. P. 297-303.

-- Bouchaud C., Bouwier D. Fine structure of tight junctions between rat choroidal cells after osmotic opening induced by urea and sucrose // Tissue Cell. 1978. Vol. 10. P. 331 - 343.

-- Branton D., Bullivant S., Gilula N. B. el al. Freeze-etching nomenclature // Science. 1975. Vol. 190. P. 54-56.

-- Branton D., Deamer D. Membrane structure // Protoplasmatologia. 1972. Vol. 1. P. 1 - 16.

-- Branton D., Kirchanski S. Interpreting the results of freeze-etching // J. Microsc. 1977. Vol. 111. P. 117-124.

-- Braun J., Abnev J., Owicki J. How a gap junction maintains its structure // Nature. 1984. Vol. 310. P. 316-318.

-- Bray D. F., Ryans D. G. A comparative Freeze-etch study of the sarcoplasmic reticulum of avian fast and slow muscle fibers // J. Ultrastruct. Res. 1976. Vol. 57. P. 251-259.

-- Breipohl W., Mendoza A. S., Miragall F. Freeze-etching studies on the ciliary necklace in the rat and chick // J. Anat. 1980. Vol. 130. P. 801-807.

-- Bretscher M. S., Raff M. C. Mammalian plasma membranes // Nature. 1975. Vol. 258. p. 43-45.

-- Bretscher M. S., Whytock S. Membrane-associated vesicles in fibroblasts // J. Ultrastruct. Res. 1977. Vol. 61. P. 215-217.

-- Bridgman P. C, Nakajima S., Greenberg A. S., Nakajima Y. Freeze-fracture and

electrophysiological studies of nowly developed acetylcholine receptors in Xenopus embryonic muscle cells // J. Cell Biol. 1984. Vol. 98. P. 2160-2173.

-- Brown A. D. Hydrogen ion titrations of intact and dissolved lipoprotein membranes // J. Mol. Biol. 1965. Vol. 12. P. 491-508.

-- Brown D., Montesano R. Membrane specialization in the rat epididymis. 2. The clear cell // Anat. Rec. 1981. Vol. 201. P. 477- 483.

-- Brown D., Montesano R., Orci L. Patterns of filipin-sterol complex distribution in intact erythrocytes and intramembrane particle aggregated ghost membranes // J. Histochem. Cytochem. 1982. Vol. 30. P. 702 -710.

-- Brown D., Orci L. Interactions of lectins with specific cell types in toad urinary bladder. Surface distribution revealed by colloidal gold probes and label fracture // J. Histochem. Cytochem. 1986. Vol. 34. P. 1057-1062.

-- Brummer F., Witerhager E., Denker H. W. Hulser D. F. Cell-cell communication via gap junctions in rabbit uterine epithelium related to implantation // Europ. J. Cell Biol. 1985. Vol. 36. P. 11 - 17.

-- Bullivant S. Frceze-fracturing of biological materials // Micron. 1969. Vol. 1. P. 46- 51.

-- Bullivant S. Freeze-etching and freeze-fracture // Advanced techniques in biological electron microscopy / Ed. J. K. Koehler. Berlin, 1973. P. 67-83.

-- Bullivant S. Freeze-etching techniques applied to biological membranes // Phil. Trans. Roy. Soc. London. 1974. Vol. 268. P. 5-22.

-- Bullivant S. Evidence that the tight junction sealing element consists of two side-bv-side fibres // J. Cell Biol. 1976. Vol. 70. P 35a.

-- Bullivant S. Evaluation of membrane structure facts and artefacts produced during freeze-fracturing // J. Microsc. (Gr. Brit.). 1977. Vol. 111. P. 101 - 116.

-- Bullivant S. Advantages and limitations of simple cold block freeze-fracture technique // 38th Annu. Meet. Electron Microsc. San Francisco, 1980. P. 748-751.

-- Bullivant S., Weinstein R. S., Someda K. The type II simple freeze-cleave device // J. Cell Biol. 1968. Vol. 39. P. 19a.

-- Burghardt R. C., Anderson E. Hormonal modulation of gap junctions in rat ovarian follicles // Cell Tissue Res. 1981. Vol. 214. P. 181 - 193.

-- Burns C. P., Hoak ]. C. Freeze-etch studied of the granules of human mast cells eosinophils // J. Ultrastruct. Res. 1975. Vol. 50. P. 143-149.

-- Caedwell R. В., McLaughlin B. J. Freeze-fracture study of filipin binding in photoreceptor outer segments and pigment epithelium of distrophic and normal retina // J. Comp Neurol. 1985. Vol. 236. P. 523-537.

-- Camatini M., De Curtis I., Franchi E. Dinamic aspect of inter-Sertoli junctions in monkeys // J. Ultrastruct. Res. 1982. Vol 79 P. 314-326.

-- Camatini M., Franchi E., De Curtis I.

Sertoli junctions in human testis: a freeze-

fracture and lanthanum tracer study //

J. Submicrosc. Cytol. 1979. Vol. 11. P. 511 -

516.

-- Campbell F. R. Gap junctions between cells of bone marrow: an ultrastructural study using tannic acid // Anat. Rec. 1980. Vol. 196. P. 101 - 117.

-- Caputo R., Gianotti P. Junctions between hi-stocytes: role of coated vesicles //J. Ultrastruct. Res. 1979. Vol. 68. P. 256-264.

-- Caputo R., Peluchetti D. The junctions of normal human epidermis. A freeze-fracture study // J. Ultrastruct. Res. 1977. Vol. 61. P. 44-61.

-- Carno-Forscen M. Testosterone-induced changes in nuclear pore complex number of prostatic nuclei from castrated rats // J. Ultrastruct. Res. 1982. Vol. 80. P. 243-251.

-- Carpentier J., Perrelet A., Orci L. Morphological changes of the adipose cell plasma membrane during lipolysis //J. Cell Biol. 1977. Vol. 72. P. 104-117.

-- Carson S. L., Collier A. M., Ни S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro // J. Ultrastruct. Res. 1980. Vol. 70. P. 70-81.

-- Caspar D. L. D., Goodenough D. A., Makow-ski L., Philips W. C. Gap junction structures. 1. Correlated electron microscopy and X-ray diffraction // J. Cell Biol. 1977. Vol. 74. P. 605-628.

-- Cavoto F. V., Flaxman B. A. Low-resistance pathways between mitotic and interphase epidermal cells in vitro // J. Cell Biol. 1973. Vol. 58. P. 223-225.

-- Chalcroft J. P., Bullivant S. An interpretation of liver cell membrane and junction structure based on observation of freeze-fracture replicas of both sides of the structure // J. Cell Biol. 1970. Vol. 47. P. 49-60.

-- Chandler D. E., Bennet J. P., Gomperts B. Freeze-fracture studies of chemotactil peptide-induced exocytosis in neutrophils: evidence for two patterns of secretory granule fusion // J. Ultrastruct. Res. 1983. Vol. 83. P. 221-232.

-- Chandler D. E., Heuser J. E. Arrest of membrane fusion events in mast cells by quick freezing //J. Cell Biol. 1980. Vol. 86. P. 666- 674.

-- Chevalier J. Modifications ultrastructurales de la membrane du globule rouge au cours de la transformation reversible disque-sphere crenelee (echinocyte) mises en evidence par la Technique du cryodecapage // J. Microsc. 1974. Vol. 20. P. 247-258.

-- Chevalier !., Bourguet J., Hugon J. S. Membrane associated particles: distribution in frog urinary bladder epithelium at rest and after oxytocin treatment // Cell Tissue Res. 1974. Vol. 152. P. 129-140.

-- Chevalier J., Pinto da Silva P., Ripoche P. et al. Structural and cytochemical differentiation of membrane elements of the apical membrane of amphibian urinary bladder epithelial cells. A label-fracture study // Biol. Cell. 1985. Vol. 55. P. 187-190.

-- ChiE. Y., Lagunoff D., Koehler J. K. Freeze-fracture study of mast cell secretion // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73. P. 2823- 2827.

-- Cieciura L., Rydzynski K., Pieta P. The ultrastructure of the mitochondrial membrane revealed by freeze-fracturing // Folia histochem. cytochem. 1984. Vol. 22. P. 234- 235.

-- Clark A. W., Branton D. Fracture faces in frozen outer segments from the guinea pig retina // Ztschr. Zellforsch. 1968. Bd 91. S. 586-603.

-- ConnelC. J. A freeze-fracture and lanthanum tracer study of the complex junction between Sertoli cells of the Canine testis // J. Cell Biol. 1978. Vol. 76. P. 57-75.

-- Cuevas P., Gutierrez D. 1. A., Reimers D. Are the pores of intramembrane particles of postsynaptic membrane transmitter-dependent channels? // Experientia. 1983. Vol. 39. P. 596-598.

-- Cuevas P., Gutierrez D. J. A., Reimers D. Assemblies of intramembranous particles in astrocytoma: a preliminary report // Acta anat. 1984. Vol. 118. P. 107-109.

-- Cuevas P., Gutierrez D. J. A, Reimers D. et al. Aspects of interastrocytic gap junctions in blood-brain barrier in the experimental penumbra area, revealed by transmission electron microscopy and freeze-fracture // Experientia. 1984. Vol. 40. P. 471-473.

-- Cuevas P..Gutierrez D. J. A., Reimers D. et al. Pericyte-endothelial gap junctions in human cerebral capillaries // Anat. Embryol. 1984. Vol. 170. P. 155-159.

-- Cullls P. R., Hope M. J. Effects of fusoge-nic agent on membrane structure of erythrocyte ghost and mechanism of membrane fusion // Nature. 1978. Vol. 271. P. 672-674.

-- Daikoku S., Shinohera V., Watanabe V. G. The appearance of lipid cells in freeze-etched preparations // Arch. Histol. Jap. 1973. Vol. 35. P. 395-401.

-- Daikoku S., Takahashi Т., Kojimoto H., Watanabe V. G. Secretory surface phenomena in freeze-etched preparations of the adenohy-pophysial cells and neurosecretory fibres // Ztschr. Zellforsch. 1973. Bd 136. S. 207-214.

-- Danielti J. F., Davson H. J. A. Contribution to the theory of permeability of thin films // J. Cell Сотр. Physiol. 1935. Vol. 5. P. 495-508.

-- De Camilli P., Peluchetti D., Meldolesli J. Dynamic changes of the luminal plasmalem-ma in stimulated parotid acinar cells. A freeze-fracture study // J. Cell Biol. 1976. Vol. 70. P. 59-74.

-- De Maziere A. M., Scheuermann D. W., Aertgeerts P. A. Complementarity of particles and pits in freeze-fractures hepatic and cardiac gap junctions // J. Membrane Biol. 1987. Vol. 97. P. 101 - 115.

-- Decker R. S. Gap junctions and steroidogenesis in the fetal mammalian adrenal cortex // Develop. Biol. 1981. Vol. 82. P. 20-31.

-- Delbos M., Miller K. R.. Gipouloux J. D. Freeze-fracture of Rana pipiens gonad anlage: study of primordial germ cells and others cellular types // Arch. anat. microsc. morphol. exp. 1984. Vol. 73. P. 57-67.

-- Deleers M., Mahy M., Malaisse W. J. Glucose increases cytosoiic Ca++ activity in pancreatic islet cells // Biochem. Intern. 1985. Vol. 10. P. 97-103.

-- Demel R. A., Kruijff B. The function of sterols in membranes // Biochim. biophys. acta. 1976. Vol. 457. P. 109-132.

-- Dermietzel R. Distribution of partcle elements at the axolemma of preterminal and terminal vegetative nerve fibers as revealed freeze-fracture-etching // Experientia. 1972. Vol. 28. P. 1087-1089.

-- Dermietzel R., Kroszek H. Interlarnellar tight junctions of central myelin. 1. Developmental mechanisms during myelogenesis // Cell Tissue Res. 1980. Vol. 213. P. 81-94.

-- Devine С. E., Rayns D. A. Freeze-fracture studies of membrane systems in vertebrate muscle. 2. Smooth muscle // J. Ultrastruct. Res. 1975. Vol. 51. P. 293-306.

-- Dorovini-Zis K., Bowman P. D., Betz A. L., Goldstein G. W. Hyperosmotic arabinose solutions open the tight junctions between brain capillary endothelial cells in tissue culture // Brain Res. 1984. Vol. 302. P. 383-386.

-- Doty S. Morphological evidence of gap junctions between bone cells // Calcified Tissue Intern. 1981. Vol. 33. P. 509-512.

-- Drochmans P., Freudenstein C, Wanson J. C. et at. Structure and biochemical composition of desmosomes and tonofilaments isolated from calf muzzle epidermis // J. Cell Biol. 1978. Vol. 79. P. 427-443.

-- Dubochet ]., Lepault J., Freeman R. et at. Electron microscopy of frozen water and aques solutions // J. Microsc. (Or. Brit.). 1982. Vol. 128. P. 219-237.

-- Dunn /., Revel J. P. Association of gap junctions with endoplasmic reticulum in rat parotid glands // Cell Tissue Res. 1984. Vol. 238. P. 589-594.

-- Duvert M., Mazat 1. P., Bazets A. L. Inter-mitochondrial junctions in the heart of the frog, Rana esculenta. A thin-section and freeze-fracture study // Cell Tissue Res. 1985. Vol. 241. P. 129-137.

-- Edwards H. H., Mieller T. J., Morrison M. Distribution of transmembrane polipeptides in freeze-fracture // Science. 1979. Vol. 203. P. 1343-1346.

-- Edwards H. H., Mueller T. J., Morrison M. Monolayer freeze-fracture a modified procedure II i. Electron. Microsc. Techn. 1986. Vol. 3. P. 439-451.

-- Eldrup E., Mosllgard K., Bindslev N. Possible epithelial sodium channels visualized by freeze-fracture // Biochim. biophys. acta. 1980. Vol. 596(1). P. 152-157.

-- Ellas P. M., Friend D. S. The permeability barrier in mammalian epidermis //J. Cell Biol. 1975. Vol. 65. P. 180-191.

-- Elissman M. H., Brooke M. H., Kaiser К- K., Rash J. E. Appearance in slow muscle sarco-lemma of specializations characteristic of fast muscle after reinnervation by a fast muscle nerve // Exp. Neurol. 1978. Vol. 58. P. 59-67.

-- Favre D., Bagger-Sjobach D., Mbiene J. P.,

Sans A. Freeze-fracture of the vestibular hair

cell surface during development // Anat. Embryol. 1986. Vol. 175. P. 69- 76.

-- Fettkamp C. A., Van Der Waerden A. W. M.

Membrane-associated proteins affect the formation of filipin-cholesterol complexes in

viral membranes // Exp. Cell Res. 1982. Vol. 40. P. 289-298.

-- Ferguson D. G., Schwartz H. W., Franzlni-Armstrong C. Subunit structure of junctional feet in triads of skeletal muscle: a freeze-drying, rotary-shadowing study // J. Cell Biol. 1984. Vol. 99. P. 1735-1742.

-- Fields R. D., Black LA., Waxman S. G. Filipin-cholesterol binding in CHS axons prior to myelination: evidence for microheterogenity in premyelinated axolemma // Brain Res. 1987. Vol. 404. P. 21-32.

-- Filschie В. K., Flower N. E. Junctional structures in hydra // J. Cell Sci. 1977. Vol. 23. P. 151 - 172.

-- Finean 1. B. The role of water in the structure of peripheral nerve myelin // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1957. Vol. 3. P. 92-102.

-- Fischer K. A. Monolayer freeze-fracture autoradiography: origins and directions //J. Microsc. (Gr. Brit.). 1982. Vol. 126. P. 1-8.

-- Fischer K. A., Yanagimoto К. C. Planar Freeze-fracture of radioiodinated erythrocyte membranes: effects of splitting on transmembrane polypeptides // J. Cell Biol. 1984. Vol. 99. P. 280a.

-- Fleisher S., Fleisher В., Stoeckenius S. W. Fine structure of lipid-depleted mitochondria // J. Cell Biol. 1967. Vol. 32. P. 193- 201.

-- Fletcher W. H., Anderson N. C, Everitt J. W. Intercellular communication in the rat anterior pituitary gland // J. Cell Biol. 1975. Vol. 67. P. 458-476.

-- Forssman W. G., Metz J., Heinrich D. Gap junctions in the hemotrichorial placenta of the rat // J. Ultrastruct. Res. 1975. Vol. 53. P. 374-381.

-- Fowler V., Bennet V. Association of spectrin with its membrane attachment site restricts lateral mobility of human erythrocyte integral membrane protein // J. Supramol. Struct. 1978. Vol. 8. P. 215-221.

-- Frank 1. S., Beydler S. Intercellular connections in rabbit heart as revealed by quick-frozen, deep-etched, and rotary-replicated papillary muscle // J. Ultrastruct. Res. 1985. Vol. 90. P. 183-193.

-- Franke K. Freeze-fracture aspects of the junctional complexes in the round window membrane // Arch. Oto-Rhino-Laringol. 1977. Vol. 217. P. 331-337.

-- Franke W. W., Spring H., Scheer U., Zerban H. Growth of the nuclear envelope in the vegetative phase of the green alga Acetabularia. Evidence for assembly from membrane components synthesized in the cytoplasm // J. Cell Biol. 1975. Vol. 66. P. 681-689.

-- Freeze-fracture / Eds. J. Rash, C. Hidsin. New York, 1979. 204 p.

-- Friederici H. H. R. Freeze-fracture observation on the interstitial connective tissue J. Ultrastruct. Res. 1968. Vol. 24. P. 269- 285.

-- Friend D. S. Freeze-fracture // J. Electron Microsc. Techn. 1986. Vol. 4. P. 87-95.

-- Friend D. S., Bearer E. L. B-Hydroxysterol distribution as determined by freeze-fracture cytochemistry // Histochem. J. 1981. Vol. 13. P. 535-546.

-- Friend D. S., Havel G. AL, Silberklang AL, Watson J. A. Distribution and effects of cholesterol on 3-8-hydroxysterol-free eukaryotic cells // J. Cell Biol. 1980. Vol. 87. P. 196a.

-- Friend D. A., Gilula N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues // J. Cell Biol. 1972. Vol. 53. P. 758-776.

-- Fry G. N., Devine С. E., Burnstock G. Freeze-fracture studies of nexuses between smooth muscle cells. Close relationship to sarcoplasmic reticulum // J. Cell Biol. 1977. Vol. 72. P. 26-34.

-- Frye L., Edidin AL The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterocaryons // J. Cell Sci. 1970. Vol. 7. P. 319-335.

-- Fujita H., Mishima H., Otsuka N. Freeze-fracture images of rabbit thyroid glands // Arch. Histol. Jap. 1975. Vol. 38. P. 275-284.

-- Gabella G. Quantitative morphological study of smooth muscle cells of the guinea pig Taenia coli // Cell Tissue Res. 1976. Vol. 170. P. 161 - 186.

-- Gabella G., Blundell D. Effect of stretch and contraction on caveolae of smooth muscle cells // Cell Tissue Res. 1978. Vol. 190. P. 255-271.

-- Gabella G., Blundell D. Gap junctions of the muscles of the small and large intestine // Cell Tissue Res. 1981. Vol. 219. P. 469-488.

-- Gabriel G., Thomas P. K, King R. H. At., Stolinski C, Breathach A. S. Freeze-fracture observations on human peripheral nerve// J. Anat. 1986. Vol. 146. P. 153-166.

-- Garcia R. I., Flynn E. A., Czabo G. Freeze-fracture study of mammalian skin: melano-cyte-keratinocyte interactions // Electron Microsc. 1978 : 9th Intern. Congr. Electron Microsc. Toronto, 1978. P. 652-653.

-- Garfield R. E., Merret K., Grover A. K. Gap junction formation and regulation in myometrium//Amer. J. Physiol. 1980. Vol. 239. P. 217-228.

-- Geisow M. J. Intracellular membrane traffic // Nature. 1982. Vol. 295. P. 649-650.

-- Gilula N. В., Pawcett D. W., Aoki A. The Sertoli cell occluding junctions and gap junctions in mature and development mammalian testis // Develop. Biol. 1976. Vol. 50. P. 142-168.

-- Gingell D., Ginsberg L. Problems in the physical interpretation of membrane interaction and fusion //Membrane fusion. Amsterdam, 1978. P. 791-833.

-- Ginsbach C, Fahimi H. D. Labeling cholesterol with filipin in cellular membranes of incubation conditions // Histochemistry. 1987. Vol. 86. P. 241-248.

-- Golan D. ё., Veatch J. H. Lateral mobility of band 3 in human erythrocyte membrane studied by fluorescence photobleaching recovery. Evidence for control by cytoskeletal interactions // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 2537-2541.

-- Goldberg Al, Escaig F. Appearance of freeze-fractured rat incisor enamel during the forming stage//Arch. Oral. Biol. 1982. Vol. 27. P. 971-973.

-- Goodenough D. A., Gilula N. B. The splitting of hepatocyte gap junctions and zonulae occludentes with hypertonic disaccharides// J. Cell Biol. 1974. Vol. 61. P. 575-590.

-- Goodenough D. A., Sloekenius W. The isolation of mouse hepatocytes gap junctions // J. Cell Biol. 1972. Vol. 54. P. 646-656.

-- Gordon R. E. Orthogonal arrays in normal and injured respiratory airway epithelium // J. Cell Biol. 1985. Vol. 100. P. 648-651.

-- Gotow Т., Hashimoto P. H. Regional difference in effect of filipin in plasma membranes of epithelial cells and surrounding free cells in the choriod plexus // Cell Tissue Res. 1983. Vol. 230. P. 689-694.

-- Gotow Т., Sugi Y., Hirakawa N. Ultrastructural construction of collagen fibrils as revealed by the freeze-fracture technique //J. Electron Microsc. 1983. Vol. 32. P. 213-215.

-- Grant C. W. AL, McLonned H. AL Glycopho-rin in lipid bilayers // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. Vol. 71. P. 4653-4657.

-- Green C. R., Bergquist P. Q., Bullivants S. An anastomosing septate junction in endothelial cells of the phyllum Echinodermata// J. Ultrastruct. Res. 1979. Vol. 68. P. 72-80.

-- Green D. E., Fleischer S. The role of lipids in mitochondrial electron tranfer and oxidative phosphorylation // Biochim. biophys. acta. 1963. Vol. 70. P. 554-582.

-- Green D. ё., Murer E., Nultin H. D. et al. Association of integrated metabolic pathways with membranes//Arch. Biochem. Biophys. 1965. Vol. 112. P. 635-647.

-- Greenberg J., Forsmann W. G. Studies of the guinea pig epididymis. 2. Intercellular junctions of principal cells // Anat. Embryol. 1983. Vol. 168. P. 195-209.

-- Gross H., Bas E., Moor H. Freeze-fracturing in ultrahigh vacuum at -196 °C// J. Cell Biol. 1978. Vol. 76. P. 712-728.

-- Gross H., Kuebler O., Bas ё., Moor H. Decoration of specific sites on freeze-fractured membranes // J. Cell Biol. 1978. Vol. 79. P. 646-656.

-- Gulley R. L., Reese T. S. Regional specialization of the hair cell plasmalemma in the organ of corti//Anat. Rec. 1977. Vol. 189. P. 109-123.

-- Hackenbrock C. R., Hochli AL, Chan R. M. Calorimetric and freeze-fracture analysis of lipid phase transitions and lateral translatio-nal motion of intramembrane particles in mitochondrial membranes // Biochim. biophys. acta. 1976. Vol. 455. P. 466-471.

-- Haest C. W. M., Verkleij A. J., De Gier J. et al. The effect of lipid phase transitions on the architecture of bacterial membranes // Biochim. biophys. acta 1974. Vol. 356. P. 17- 33.

-- Hama K. Gap junctions between hair cells and supporting cells in the goldfish saccular macula. A freeze-fracture study // Nagoya J. Med. Sci. 1980. Vol. 42. P. 71-74.

-- Harrison В. H. Intercellular junctions in the developing mammalian thymus // Ztschr. Ve-terinarmed. 1977. Bd 6. S. 325-331.

-- Hasegawa T. Freeze-etching observations of the human epidermis and lahgerhans cell // Pros. 10th Intern. Congr. Anat. Tokyo, 1975. P. 303.

-- Hasty D. L., Hay E. D. Freeze-fracture studies of the developing cell surface. 1. The plasmalemma of the corneal fibroblast // J. Cell Biol. 1977. Vol. 72. P. 667-686.

-- Heath I. B. A simple and inexpensive liquid helium cooled "slamfreezing" device // J. Microsc. (Gr. Brit.). 1984. Vol. 135. P. 75- 82.

-- Henderson R. The structure of purple membrane from Halobacterium Halobium: analysis of X-ray diffraction patterns//J. Mol. Biol. 1975. Vol. 93. P. 123-128.

-- Hendersor R., Eibl H., Weber K. Structure and biochemistry of mouse hepatic gap junction //J. Mol. Biol. 1979. Vol. 132. P. 193- 218.

-- Henderson R., Unwin P. N. T. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy // Nature. 1975. Vol. 257. P. 28-31.

-- Herbert D. C. Intercellular junctions in the rhesus monkey pars distalis // Anat. Rec. 1979. Vol. 195. P. 1-5.

-- Hertzberg E. L., Spray D. C, Bennet M. V. An antibody to gap junctions blocks gap junctional conductance // J. Cell Biol. 1984. Vol. 99, N 4. Pt 2. P. 343a.

-- Heuser J. E. Quick-freezing evidence in favour of the vesicular hypothesis // Trends Neurosci. 1978. Vol. 1. P. 80-82.

-- Heuser J. E., Evans L. Three-dimesional visualization of coated vesicle formation in fibroblasts//J. Cell Biol. 1980. Vol. 84. P. 560-583.

-- Heuser J. E., Kirschhausen T. Deep-etch views of clathrin assemblies //J. Ultrastruct. Res. 1985. Vol. 92. P. 1-27.

-- Heuser J. E., Reese T. S., Dennbro M. J. et at. Synaptic vesicle exocytosis captures by quick freezing and correlated with quantal transmitter release // J. Cell Biol. 1979. Vol. 81. P. 275-300.

-- Hirano A., Dembilzer H. M. Morphology of normal central myelinated axons // Histology and pathobiology of axons / Ed. S. G. Waxman. New York, 1978. P. 65-82.

-- Hirokawa N. A freeze-fracture study of intercellular junctions between various kinds of epithelial cells surrounding common endolymphatic space in the hearing orpan of the chick//Anat. Rec. 1980. Vol. 196. P. 129- 143.

-- Hirokawa N. The intramembrane structure of tight junctions. An experimental analysis of the single-fibril and two fibril model using the quick-freeze method//J. Ultrastruct. Res. 1982. Vol. 80. P. 288-301.

-- Hirokawa N. Quick-freeze, deep-etch visualization of the axonal cytoskeleton // Trends Neurosci. 1986. Vol. 9. P. 67-71.

-- Hirokawa N., Tilney L. G. Interaction between actin filaments and membranes in quick-frozen deeply etched hair cells of the chick ear//J. Ceil Biol. 1982. Vol. 95. P. 249-261.

-- Hirsch M., Renard G., Faure J. P., Poull-quen Y. Study of the ultrastructure of the rabbit corneal endothelium by the freeze-fracture technique: apical and lateral junctions // Exp. Eye Res. 1977. Vol. 25. P. 277 -288.

-- Hirsch M., Renard G., Faure J. P., Pouli-quen Y. Endothelial cell junctions in the ciliary body microvasculature. A freeze-fracture study in the rabbit // Graefe's Arch. klin. exp. Ophthalmol. 1978. Vol. 208. P. 69-79.

-- Hong K.. Hubell W. L. Preparations and properties of phospholipid bilayers containing rhodopsin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1972. Vol. 69. P. 2617 -2622.

-- Hull В. E., Staehelin L. A. The terminal web. A reavaluation of its structure and function // J. Cell Biol. 1979. Vol. 81. P. 67-82.

-- Humbert F., Montezano R., Perrelet A., Orci L. Junctions in developing human and rat kidnevs: a freeze-fracture study // J. Ultrastruct. Res. 1976. Vol. 56. P. 202-214.

-- Hunziker E. В., Herrmann W., Schenk K. R. K. et al. Cartilage ultrastructure after high pressure freezing, freeze substitution and low temperature embedding. 1. Chondrocyte ultrastructure-implications for theories of mineralization and vascular invasion // J. Cell Biol. 1984. Vol. 98. P. 267-276.

-- Huttner I., Peters H. Heterogenity of cell junctions in rat aortic endothelium: a freeze-fracture study//J. Ultrastruct. Res. 1978. Vol. 64. P. 303-308.

-- Huttner I., Walker C., Gabbiani G. Aortic endothelial cell during regeneration. Remodelling of cell junctions, stress fibers and stress fiber-membrane attachment domains // Lab. Invest. 1985. Vol. 53. P. 287- 302.

-- Ikeda M., Shibata Y., Yamamoto T. Rapid formation of myometrial gap junctions during parturition in the unilaterally implanded rat uterus//Cell Tissue Res. 1987. Vol. 248. P. 297-303.

-- Inoue S., Hogg 1. C. Freeze-fracture study of the tracheal epithelium of normal guinea pigs with particular reference to intercellular junctions // J. Ultrastruct. Res. 1977. Vol. 61. P. 89-99.

-- Inouye S., Kawakami K., Usuku G. et at. A freeze-fracture study on the tissue cells of the rat uterus in the early postpartum stage//J. Electron Microsc. 1983. Vol. 32. P. 152-162.

-- Ishikawa H., Fukuda Y., Yamada E. Freeze-replica observations on frog sartorius muscle. 1. Sarcolemmal specialization//J. Electron Microsc. 1975. Vol. 24. P. 97-107.

-- Ishimura K., Kawamata S., Fujita H. Freeze-fracture images of mammary glands of lactating mice // Anat. Embryol. 1981. Vol. 163. P. 173-183.

-- Ishimura K., Okamoto H., Fujita H. Freeze-etching studies on ultrastructural changes of endothelial cells in the thyroid of normal, TSH-treated and Thyradin-treated mice // Cell Tissue Res. 1976. Vol. 175. P. 313-317.

-- Isobe Y., Shimada Y. Organization of filaments underneath the plasma membrane of developing chicken skeletal muscle cells in vitro revealed by the freeze-dry and rotary replica method // Cell Tissue Res. 1986. Vol. 244. P. 47-56.

-- Iterson W. Die feinestruktur der Bakterien-zelle // Mikroskopie. 1966. Vol. 21. P. 107- 121.

-- lwashita K., Oguchi H., Furukawa T. et al. Ultrastructural study of glomerular slit diaphragm by quick-freezing and deep-etching replica method // J. Clin. Electron Microsc, 1986. Vol. 19. P. 404-405.

-- lahnke K., Baur P. Freeze-fracture study of taste bud pores in the foliate papillae of the rabbit//Cell Tissue Res. 1979. Vol. 200. P. 245-256.

-- Janagoda AL, Noda H. Molecular organization of cell membranes isolated from myxa-moeba of cellular slime mold Dictyosteiium discoideum. Reassociation of membrane subu-nits // J. Biochem. 1969. Vol. 65. P. 709-731.

-- Jezernik K., Pipan N. Changes of tight junctional elements in the membrane plane in the cells of exocrine pancreas // Period. Biologorum. 1979. Vol. 81. P. 656-661.

-- Jezernik K., Pipan N. Changes of plasma-lemma and endomembranes in mouse parotid acinar cells: freeze-fracture study in intramembrane particles // Period. Biologorum. 1985. Vol. 87. P. 61-65.

-- Jllk V., Brown D. Modification of mitochondria-rich cells in different ionic conditions: changes in cell morphology and cell number in the skin of Xenopus laevis // Anat. Rec. 1980. Vol. 196. P. 153-161.

-- Johnson R., Hammer AL, Sheridan J. Gap junction formation between reaggregated No-vikoff hepatoma cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. Vol. 71. P. 4536-4540.

-- Kachadorian W. A., Muller J., Rudich S. W., Discala V. A. Temperature dependence of ADH-induced water flow and intramembra-nous particle aggregates in toad bladder // Science. 1979. Vol. 205. P. 910-913.

-- Kachar В., Pinto da Silva P. Freeze-fracture study of rat ventral prostate: secretory mechanisms in the epithelial cell // Anat. Rec. 1980. Vol. 198. P. 549-565.

-- Kachar В., Reese T. S. Formation of misplaced and reflexive tight junction strands in prostate epithelial cells//J. Ultrastruct. Res. 1983. Vol. 82. P. 90-95.

-- Kan F. W. K., Kopriwa В., Leblond C. P. An improved method for freeze-fracture radiography of tissues and cells as applied to duodenal epithelium and thymic lymphocytes // J. Histochem. Cytochem. 1984. Vol. 32. P. 17-29.

-- Kanaseki T. An examination of fixation artefacts studied with both sectioning and quick-frozen-replica techniques//J. Electron Microsc. 1986. Vol. 35. P. 1973-1976.

-- Kannan M. S., Daniel E. E. Formtion of junctions by treatment in vitro with potassium conductance blockers // J. Cell Biol. 1978. Vol. 78. P. 338-349.

-- Kanno G., Loewenstein W. R. Cell-to-cell passage of large molecules//Nature. 1966. Vol. 212. P. 629-630.

-- Karderon N., Gilula N. B. Membrane events involved in myoblast fusion//J. Cell Biol. 1979. Vol. 81. P. 411-425.

-- Kataoka K., Maesako J., Yamamoto AL, Toyota T. Intercellular junctions in the gastric mucosa of mice and rats // J. Electron Microsc. 1986. Vol. 35. P. 2877-2878.

-- Katchbarian ё., Severs N. J. Matrix consti-tutiens of early developing bone examined by freeze-fracture//Cell Biol. Intern. Repts. 1983. Vol. 7. P. 1063-1070.

-- Kelly A. At., Chako S. Internal membrane junctions and unusual T-tubules in cultural chick cardiac muscle cells // J. Mol. Cell. Cardiol. 1977. Vol. 9. P. 419-424.

-- Kelly D. E. Three-dimensional ultrastructure of adhesion sites in developing amphibian epidermis // Science. 1965. Vol. 150. P. 376-381.

-- Kelly D. E. Models of muscle Z-band fine structure based on a looping filament configurations//J. Cell Biol. 1967. Vol. 34. P. 827-836.

-- Kerjaschki D. Some freeze-etching data on the olfactory epithelium//Proc. 6th Intern. Symp. Olfaction and Taste. Paris, 1977. London; Washington (D. C), 1978. P. 75-85.

-- Kikkawa V., Manabe T. The freeze-fracture study of alveolar type II cells and alveolar content in fetal rabbit lung // Anat. Rec. 1983. Vol. 190. P. 627-637.

-- Kirchanski S., Eigsaeter A., Chukareff W., Branton D. Low-temperature freeze-fractu-ring to avoid plastic distortion // Freeze fracture: methods, artefacts and interpretations / Eds. J. E. Rash, C. S. Hudson. New York, 1979. P. 149.

-- Kitaoka Т., Fujimoto K., Hirata A. et al. Lectin binding sites of guinea pig retinas frozen thin-sectioning and freeze-fracturing study with lectin-ferritin // J. Electron Microsc. 1986. Vol. 35. P. 3219-3220.

-- Knutton S. Structural changes in the plasma membrane of synchronized P815Y mastocytoma cells // Exp. Cell Res. 1979. Vol. 102. P. 109-116.

-- Kogon AL, Papas G. D. Atypical gap junctions in the ciliary epithelium of the albino rabbit eye//J. Cell Biol. 1975. Vol. 66. P. 671-676.

-- Kohno K., Noguchi N. Large myelinated club endings on the Mauthner in the goldfish. A study with thin sectioning and freeze-fracturing // Anat. Embryol. 1986. Vol. 173. P. 361-370.

-- Koling A., Rask-Andersen H. Membrane structures in the pulpdentin border zone. A freeze-fracture study of demineralized human teeth//Acta odontol. scand. 1984. Vol. 42. P. 73-84.

-- Koling A., Rask-Andersen H., Sjoback D. Membrane junctions on odontoblasts. A freeze-fracture study // Acta odontol. scand. 1981. Vol. 39. P. 355-360.

-- Kordylewskl L., Karrison Т., Page E. Measurements on the internal structure of freeze-fractured cardiac plasma membrane // Amer. J. Physiol. 1985. Vol. 248. P. 297-304.

-- Kordylewsky L., Karrison I., Page E. Developmental changes in P-face and E-face particle densities of Xenopus cardiac muscle plasma membrane//Tissue Cell. 1986. Vol. 18. P. 793-801.

-- Кот E. D. Current concepts of membrane structure and function // Fed. Proc. 1969. Vol. 28. P. 6-11.

-- Kraus R., Martinek J. Freeze-fracture analysis of the adrenal medulla in the rat // Folia morphol. 1982. Vol. 30. P. 370-373.

-- Kristol C, Sandri C, Akert K., Moor H. Intramembranous particle distribution at the node of Ranvier in mammalian spinal cord axons // Experientia. 1977. Vol. 33. P. 882- 885.

-- Krstic R. Ultrastructure of rat pineal gland after preparation by freeze-etching technique//Cell Tissue Res. 1974. Vol. 148. P. 371-379.

-- Krstic R. Beitrag zur Kenntnis der "synaptic ribbons" in der glandula pinealis der Ratte // Anat. Anz. 1975. Bd 138. S. 443-446.

-- KubyJ.M., Wofsy L. Intramembrane particles and organization of lymphocyte proteins // J. Cell Biol. 1981. Vol. 88. P. 591-598.

-- Kurantsiu-Mills /., Lessiu L. S. Freeze-etching and biochemical analysis of human fetal erythrocyte membranes // Pediat. Res. 1984. Vol. 18. P. 1035-1041.

-- Kuszak J. /R., Alcala J., Maisel H. Evidence for sequential replication of gap junctions in chick lens development // Exp. Eye Res. 1982. Vol. 34. P. 455-466.

-- Kuszak J. R., Macsai M. S., Bloom K. L et at. Cell-to-cell fusion of lens fiber cells in situ: correlative light, scanning electron microscopic and freeze-fracture studies // J. Ultrastruct. Res. 1985. Vol. 93. P. 144-160.

-- La Fountain J. R., Thomas H. R. The ultra-structure of spindle microtubules after freeze-etching and negative staining in situ //J. Ultrastruct. Res. 1975. Vol. 51. P. 340-347.

-- La Manila J., Shafig S. A. Developmental changes in the plasma membrane of gizzard smooth muscle of the chicken. A freeze-fracture study // J. Anat. 1983. Vol. 134. P. 243- 253.

-- Laci E. R. Intramembranous particles of different segments of the collecting duct epithelium in antidiuretic and water diuretic rats // Europ. J. Cell Biol. 1980. Vol. 22. P. 581-586.

-- Landis D. M. Initial junctions between developing parallel fibre and Purkinje cells are different from mature synaptic junctions // J. Сотр. Neurol. 1987. Vol. 260. P. 513- 525.

-- Landis D. M., Reese T. S. Membrane structure in rapidly frozen, freeze-fractured cerebellar cortex //J. Cell Biol. 1974. Vol. 63, N 2. Pt 2. P. 184a.

-- Larsen W. J. Structural diversity of gap junction. A review // Tissue Cell. 1977. Vol. 9. P. 373-394.

-- Larsen W. J. Biological implications of gap junction structure distribution and composition. A review // Tissue Cell. 1983. Vol. 15. P. 645-671.

-- Larsen W. /., Tung H. N., Polking C. Response of granulosa cell gap junctions to human chorionic gonadotropin (hGG) at ovulation // Biol. Reprod. 1981. Vol. 25. P. 1119- 1134.

-- Lawson D., Raff M. C, Gompertz B. et at. Molecular events during membrane fusion. A studv of exocytosis in rat peritoneal mast cells//J. Cell Biol. 1977. Vol. 72. P. 242- 259.

-- Leibstein A. G., Dermietzel R., Frixen U., Willecke K. Immuncytochemischer Nachweis von 26K.(Gap junction) Protein in Epithe-lien des Verdungstraktes // Anat. Anz. 1985. Bd 158. S. 229-230.

-- Letoup R., Laurent L., Ronveaux M. F. et al. Desmosomes and desmogenesis in the epidermis of calf muzzle // Biol. Cell. 1979. Vol. 34. P. 137-152.

-- Lenard J., Landsberger I. A perspective on models of membrane structure // Mammalian cell membranes. London, 1976. Vol. 1 P. 244-265.

-- Lenard J., Singer S. J. Protein conformation in cell membrane preparation as studied by optical rotatory dispersion and circular di-chroism // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1965. Vol. 15. P. 1828-1835.

-- Levin K. R., Page E. Quantitative studies on plasmalemmal folds and caveolae of rabbit ventricular myocardial cells//Circ. Res. 1980. Vol. 46. P. 244-255.

-- Loewenstein W. R. Permeability of membrane junctions//Ann. N. Y. Acad. Sci. 1966. Vol. 137. P. 441-445.

-- Lombardy Т., Montezano R., Furle M. В., Silverstetn S. C, Orel L. Endothelial diaph-ragmed fenestrae in vitro modulation by phor-bol myristate acetate // J. Cell Biol. 1986. Vol. 102. P. 1965-1970.

-- Luciano L., Reale E. La structure des elements composants les zonulae occludentes entre les cellules folliculaires de la thyroide chez le rat adulte et son evolution au cours du developpment prenatal // Biol. Cell. 1977. Vol. 29. P. 17a.

-- Luciano L., Reale E. Freeze-fractured aspects of the zonulae occludentes between mitotic follicular cells in the fetal thyroid gland of the rat // Europ. J. Cell Biol. 1980. Vol. 22. P. 244.

-- Lucy J. A. Fusogenic mechanisms // Cell fusion. London, 1984. P. 28-44.

-- Lupu F., Slmlonescu M. Organization of the intercellular junctions in the endothelium of cardiac valves // J. Submicrosc. Cytol. 1985. Vol. 17. P. 119-132.

-- Luzzati E., Hasson E. The structure of lipid-crystalline phase of lipid-water system // J. Cell Biol. 1962. Vol. 12. P. 211-220.

-- Mac Lennan D. H., Seeman P., lies G. H., Yip С. C. Membrane formation by the adeno-sin triphosphatase of sacroplasmic reticulum//J. Biol. Chem. 1971. Vol. 246. P. 2702-2709.

-- Mack A., Wolburg H. Heterogenity of glial membranes in the rat olfactory system as revealed by freeze-fracturing // Neurosci. Lett. 1986. Vol. 65. P. 17-22.

-- Makowski L., Caspar D.L.D., Phillips W. C, Goodenough D. A. Gap junction structures. 2. Analysis of the X-ray diffraction data // J. Cell Biol. 1977. Vol. 74. P. 629-645.

-- Mandel Т. E. Intramembranous marker in T-lymphocytes // Nature. New Biol. 1972. Vol. 239. P. 112-114.

-- Maraldi N. AL, Mazimelli F., Galanzi A. et al. Ultrastructural organization of freeze-fracturcd interphase nuclei // Biol. Cell. 1986. Vol. 56. P. 31-39.

-- Margaritis L. H., Yu I., Branton D. Biochemical and structural analysis of intramembrane particles using recombination experiments and rotary shadow freeze-etch microscopy//J. Cell Biol. 1976. Vol. 70. P. 73a.

-- Martinez-Patomo A., Meza I., Beaty G., Cereijido M. Experimental modulation of occluding junctions in a cultured transporting epithelium // J. Cell Biol. 1980. Vol. 87. P. 736-745.

-- Massa P. Т., Mugnaini E. Cell junctions and intramembrane particles of astrocytes and oligodendrocytes: a freeze-fracture study// Neuroscience. 1982. Vol. 7. P. 523-538.

-- Matsuda Ft.-, Fujita 11., Ishimura K. Freeze-fracture images of distribution of filipin-cholesterol complexes in the oviduct epithelium of mice//Acta histochem. cytochem. 1986. Vol. 16. P. 112 - 118.

-- Matsumura H., Setoguti T. Fine structure of human bronchial epithelium. A freeze-fracture replica study // J. Clin. Electron Microsc. 1986. Vol. 19. P. 370-371.

-- Mattox D. E.. Neises G. ё., Gulley R. L. A freeze-fracture study of the maturation of synapses in the anteroventral cochlear nucleus of the developing rat // Anat. Rec. 1982. Vol. 204. P. 281-287.

-- Maul G. G. Nuclear pore complex. Elimination and reconstruction during mitosis // J. Ceil Biol. 1977. Vol. 74. P. 492-500.

-- Maul G. G, Maul H. AL, Seogna J. E. et al. Time sequence of nuclear pore formation in phytohemagglu tin in-stimulated lymphocytes and in HeLa cells during cell cycle // J. Cell Biol. 1972. Vol. 55. P. 433-471.

-- McIntyre J. A., Gilula N. В., Karnovsky M. J. Cryoprotectant-induced redistribution of intramembranous particles in mouse lymphocyte // J. Cell Biol. 1974. Vol. 60. P. 192-203.

-- McLaughlein B. J., Boykins L. A. Freeze-fracture study of photoreceptor outer segments and pigment epithelium in dystrophic and normal retinas //J. Сотр. Neurol. 1981. Vol. 199. P. 533-567.

-- McLean В., Mazen-Lynch L., Shotton D. M. Quantitative freeze-fracture studies of membrane changes in chicken muscular dystrophy // Muscle Nerve. 1986. Vol. 9. P. 501-514.

-- Meda P., Michaels R. L., Halban P. A. et al. In vivo modulation of gap junctions and dye coupling between B-cells of the intact pancreatic islet // Diabetes. 1983. Vol. 32. P. 858- 868.

-- Meldolesi J., Castiglioni G., Parma R. et al. Ca + + dependent disassembly and reassembly of occluding junctions in pig guinea pancreatic acinar cells. Effects of drug//J. Cell Biol. 1978. Vol. 79. P. 156-173.

-- Membrane fluidity in biology / Eds. R. C. Aloia, J. M. Boggs. New York, 1985. 320 p.

-- Membrane fusion: Cell surface review / Eds. G. Poste, G. L. Nicolson. Amsterdam etc., 1978. 862 p.

-- MencoB. P. M. Qualitative and quantitative freeze-fracture studies on olfactory and nasal respiratory structures of frog, ox, rat and dog. 1. A. general survey // Cell Tissue Res. 1980. Vol. 207. P. 183-209.

-- Meyer H. W., Gross J., Richter W., Rosenthal S. Absence of differences in the membrane structure of young and old erythrocyte as evidenced by freeze-etch technique // Exp. Pathol. 1974. Vol. 9. P. 118-121.

-- Meyer R. A., McGingley D., Posalaky Z. The gastric mucosal barrier: structure of intercellular junctions in the dog //J. Ultrastruct. Res. 1984. Vol. 86. P. 192-201.

-- Miller K. R., Prescott C. S., Jacob T. L.. Lassayanal N. L. Artifacts associated with quick-freezing and freeze-drying//J. Ultrastruct. Res. 1983. Vol. 82. P. 123-133.

-- Miller R. G., Baldrige W. H. The tight junction as a barrier to cholesterol in canine epithelial cells//J. Ultrastruct. Res. 1985. Vol. 90. P. 275-285.

-- Miller R. G., Pinto da Silva P. Particle rosettes in the periaxonal Schwann cell membrane and particle clusters in the axolemma of rat sciatic nerve // Brain Res. 1977. Vol. 130. P. 135-141.

-- Miragall F., Breipohl W.. Naguro Т., Werm-bter G. Freeze-fracture study of the plasma membranes of the septal olfactory organ of masera//J. Neurocytol. 1984. Vol. 13. P. 111 - 125.

-- Mitchell P. A., Burghardt R. C. The ontogeny of nexuses (gap junctions) in the ovary of the fetal mouse // Anat. Rec. 1986. Vol. 214. P. 283-288.

-- Mollgard Saunders N. R. Complex tight junctions of epithelial and endothelial cells in early foetal brain // J. Neurocytol. 1975. Vol. 4. P. 453-468.

-- Monroy A. Processes controlling sperm-egg fusion // Europ. J. Biochem. 1985. Vol. 152. P. 51-56.

-- Monlcourrier P., Hirsch M. Intercellular junctions in the developing rat corneal endothelium//Ophthalm. Res. 1985. Vol. 17. P. 207-215.

-- Montesano R. Junctions between sinusoidal endothelial cells in fetal rat liver//Amer. J. Anat. 1975. Vol. 114. P. 387-392.

-- Montesano R., Nicolescu P. Fenestrations in endothelium of rat liver sinusoids revisited by freeze-fracture//Anat. Rec. 1978. Vol. 190. P. 861-870.

-- Montesano R., Vassalli P., Orci L. Structural heterogeneity of endocytic membranes in macrophages as reaveled by the cholesterol probe filipin // J. Cell Sci. 1981. Vol. 51. P. 95-107.

-- Moor H. Recent progress in high pressure freezing //J. Electron Microsc. 1986. Vol. 35. P. 1961 - 1964.

-- Moor H. Theory and practice of high pressure freezing // Cryotechniques in biological electron microscopy / Eds. R. A. Steinbrecht, K. Zierold. Berlin; Heidelberg, 1987. P. 175- 191.

-- Moor H., Muhlethaller K., Waldner H., Frey-Wyssling A. A new freezing ultramicro-tome //J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961. Vol. 10. P. 1 - 13.

-- Mooseker M. S., Bouder E. M., Conzel-man K. A. et at. Brush border cytoskeleton and integration of cellular functions // J. Cell Biol. 1984. Vol. 99. P. 104-112.

-- Mora-Galiudo J. Maturation of tight junctions in guinea pig cecal epithelium // Cell Tissue Res. 1986. Vol. 246. P. 169- 175.

-- Moscana A. A. Studies on cell aggregation demonstration of materials with selective cell-binding activity // Proc. Acad. Sci. USA. 1963. Vol. 49. P. 742-747.

-- Mutter M., Moor H. Cryofixation of thick specimens by high pressure freezing // The science of biological specimen preparation / Eds. J. P. Revel, T. Barnard, G. H. Haggis. Chicago, 1984. P. 131 - 138.

-- Murphy C. R. Glycerol treatment increases intramembranous particle density inuterine epithelial cells // Ztschr. mikrosk.-anat. Forsch. 1986. Bd 100. S. 121 - 124.

-- Murphy C. R., Martin B. Cholesterol in the plasma membrane of uterine epithelial cells. A freeze-fracture cytochemical study with digitonin // J. Cell Sci. 1985. Vol. 78. P. 163-172.

-- Murphy C. R., Swift J. C, Mukheriee Т. M., Roger A. W. Freeze-fracture studies of the apical membrane of uterine epithelial cells in the rat//J. Anat. 1980. Vol. 130. P. 210.

-- Murphy C. R., Swift J. G., Mukherjee Т. M., Roger A. W. Reflexive gap junctions on uterine luminal epithelial cells // Acta anat. 1982. Vol. 112. P. 92-96.

-- Nagano Т., Suzuki F. The postnatal development of the junctional complexes of the mouse Sertoli cells as revealed by freeze-fracture // Anat. Rec. 1976. Vol. 185. P. 407- 417.

-- Nagato Т., Tandler B. Gap junctions in rat sublingual gland // Anat. Rec. 1986. Vol. 214. P. 71-75.

-- Nagy Z., Peters H., Huttner I. New structural aspects of blood brain barrier. A freeze-fracture study // Fed. Proc. 1983. Vol. 42. P. 771-776.

-- Nakajima Y., Bridgman P. C. Absence of filipin-sterol complexes from the membranes of active zones and acetylcholine receptor aggregates at frog neuromuscular junctions // J. Cell Biol. 1981. Vol. 88. P. 453- 458.

-- Napolitano L., Leaboron Т.. Sealetti J. Preservation of myelin lamellar structure in the absence of lipid // J. Cell Biol. 1967. Vol. 34. P. 817- -826.

-- Navaratnam V., Kaufman M. //., Skep-per I. N. et at. Differentiation of the myocardial rudiment of mouse embryos: an ultrast-ructural study including freeze-fracture replication//J. Anat. 1986. Vol. 146. P. 65- 85.

-- Nermut M. V. Ultrastructural and chemical analysis of the membrane leaflet of the human red blood cell//Europ. J. Cell Biol. 1983. Vol. 31. P. 396-404.

-- Nermut M. V. Freeze-fracture biochemistry, cytochemistry and autoradiography of transmembrane proteins // Europ. J. Cell Biol. Vol. 36. P. 47-53.

-- Neutra M. R. Linear arrays of intramem-brane particles on microvilli in primate large intestine // Anat. Rec. 1979. Vol. 193. P. 367 -381.

-- Nicolson G. L. Transmembrane control of the receptors on normal and tumor cells. 1. Cytoplasmic influence over cell surface components // Biochim. biophys. acta. 1976. Vol. 457. P. 57-78.

-- Nicolson G. L., Painter R. G. Anionic sites of human erythrocyte membranes. 2. Transmembrane effects of antispectrin on the topography of bound positiveli changed colloidal particles//J. Cell Biol. 1973. Vol. 59. P. 395-406.

-- Noguchi Y., Shibata Y., Yamamoto T. Endothelial vesicular system in rapid-frozen muscle capillaries revealed by serial sectioning and deep etching//Anat. Rec. 1987. Vol. 217. P. 355-360.

-- Ohtake N. Attachment of cytoskeletons to cell membranes in human blood plateles as revealed by the quick-freezing and deep etching replica methods //J. Ultrastruct. Res. 1986. Vol. 95. P. 84-95.

-- O'Kelley R., Shipper В. E. Development of the aging cell surface: variation in the distribution of intramembrane particles with progressive age of human diploid fibroblasts// J. Ultrastruct. Res. 1977. Vol. 59. P. 113- 118.

-- Onho S., Terada N., Ohtake N., Fujii Y. Electron microscopic study on cytoplasmic sides of normal human erythrocyte membranes by quick-freezing and deep-etching replica method // J. Clin. Electron Microsc. 1985. Vol. 18. P. 508a.

-- Orci L. Macro- and micro-domains in the endocrine pancreas // Diabetes. 1982. Vol. 31. P. 538-565.

-- Orci L., Amherdz M., Montesano R. et at. Topology and morphologically detectable protein and cholesterol in number membranes of polypeptide-secreting cells // Phil. Trans. Roy. Soc. London B. 1981. Vol. 296. P. 47- 54.

-- Orci L., Brown D. Distribution of filipin-sterol complexes in plasma membranes of the kidney. 2. The thin limbs of Henle's loop // Lab. Invest. 1983. Vol. 48. P. 80-89.

-- Orci L., Brown D., Amherdt M., Perrelet A. Distribution of intramembrane particles and filipin-sterol complexes in plasma membrane of kidney. 1. Corpuscle of Malpighi // Lab. Invest. 1982. Vol. 46. P. 545-559.

-- Orci L., Humbert F., Brown D., Perrelet A. Membrane ultrstructure in urinary tubules // Intern. Rev. Cytol. 1982. Vol. 73. P. 27-89.

-- Orci L., Montesano R., Meda P. et al. Heterogeneous distribution of filipin-cholesterol complexes across the cisternae of the Qolgi apparatus // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 293-297.

-- Orci L., Perrelet A. Freeze-etch histology. A comparison between thin section and freeze-etch replicas. Berlin, 1975. 168 p.

-- Orci L., Perrelet A., Malaisse-Lagae F., Vassali P. Porelike structures in biological membranes//J. Cell Sci. 1977. Vol. 25. P. 157 161.

-- Packer L., Mehard C. W., Meissner G., Zahler W. L., Fleischner S. The structural role of lipids in mitochondrial and sarcoplasmic reticulum membranes. Freeze-fracture EM studies // Biochim. biophys. acta. 1974. Vol. 383. P. 159-181.

-- Patacios G. Cell junctions in the adrenal cortex of the postnatal rat // J. Anat. 1979. Vol. 129. P. 695-701.

-- 379. Pears B. Clatrin: A unique protein associa-

ted with intracellular trans for membrane by coated vesicles // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. Vol. 73. P. 1255-1259.

-- Peek W., Shivers R., McMillan D. Freeze-fracture analysis of functional complexes in the nephron of the garter snake, Thanophils sirtalis // Cell Tissue Res. 1977. Vol. 179. P. 441-451.

-- Peng H., Jeffe L. A simple, selective method for freeze-fracturing spherical cells // J. Cell Biol. 1976. Vol. 71. P. 674-680.

-- Peracchia C. Cell coupling//Enzymes of biological membranes. New York; London, 1985. Vol. 1. P. 81 - 130.

-- Pfenninger K., Bunge R. Freeze-fracturing of nerve growth cone and young fibers. A study of developing plasma membrane // J. Cell Biol. 1974. Vol. 63. P. 180-198.

-- Pfenninger K., Rinderer E. Methods for the freeze-fracturing of nerve tissue cultures and cell monolayers // J. Cell Biol. 1975. Vol. 65. P. 15-28.

-- Pinto da Sitva P., Barbosa AL, Aguas A. Aquide to fracture label: cytochemical labeling of freeze-fractured cells. Advanced techniques in biological electron microscopy / Ed. J. Koehler. Berlin etc., 1986. P. 201-227.

-- Pinto da Silva P., Douglas S., Branton D. Localization of antigen sites on human erythrocyte ghost // Nature. 1971. Vol. 232. P. 194-198.

-- Pinto da Silva P., Gilula N. Gap junction in normal and transformed fibroblasts in culture // Exp. Cell Res. 1972. Vol. 71. P. 293- 401.

-- Pinto da Silva P., Kan F. Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surface // J. Cell Biol. 1984. Vol. 99. P. 1156- 1161.

-- Pinta da Silva P., Martinez-Palomo A. Distribution of membrane particles and gap junctions in normal and transformed 3T3 cells studied in situ, in suspension and treated with concavalin A // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. Vol. 72. P. 572.

-- Pinto da Silva P., Miller R. Membrane particles on fracture faces of frozen myelin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. Vol. 72. P. 4046-4050.

-- Pinto da Silva P., Niclson G. Freeze-etch localization of concavalin A receptors to the membrane intercalated particles of human erythrocyte ghost membranes//Biochim. biophys. acta. 1974. Vol. 363. P. 311-319.

-- Pinto da Silva P., Parkinson C., Dweer N. Fracture label cytochemistry of freeze-fracture faces in the erythrocyte membrane // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 343-347.

-- Pinto da Silva P., Parkinson C., Dweer N. Freeze-fracture cytochemistry: thin sections of cells and tissues after labeling of fracture face // Histochem. Cytochem. 1981. Vol. 29. P. 917-928.

-- Pinto da Silva P., Torrisi AL, Kochar R. Freeze-fracture cytochemistry: localization of wheat-germ agglutinin and concavalin A binding sites of freeze-fracture pancreatic cells // J. Cell Biol. 1981. Vol. 91. P. 361-372.

-- Pitelka D., Hamamoto S., Duafala J., Me-manie M. Cell contacts in the mouse mammary gland. 1. Normal gland in postnatal development and the secretory cycle //J. Cell Biol. 1973. Vol. 56. P. 797-818.

-- Polak-Charton S., Sholam /., Ben-Shaul J. Junction formation in trypsinized cells of human adenocarcinoma cell line // Exp. Cell. Res. 1978. Vol. 116. P. 1 - 13.

-- Porter K., Anderson K. The structure of the cytoplasmic matrix preserved by freeze-drying and freeze-substitution // Europ. J. Cell Biol. 1982. Vol. 29. P. 83-96.

-- Poste G., Pasternak C. Virus-induced cell fusion // Membrane fusion. Amsterdam etc., 1978. P. 305-367.

-- Prescott L., Brightman M. The sarcolemma of Aplysia smooth muscle in freeze-fracture preparations // Tissue Cell. 1976. Vol. 8. P. 241-258.

-- Quatacker J. Cell contacts in rabbit corpora lutea//J. Ultrastruct. Res. 1975. Vol. 50. P. 299-305.

-- Rash I. Freeze-fracture // Intern. Rev. Cytol. 1982. Vol. 30. P. 332-367.

-- Rash J., Hudson C., Graham W., Mayer R. Freeze-fracture studies of patients with neuromuscular disease // Neurology. 1979. Vol. 29. P. 594.

-- Rash J., Staehelin L. Freeze-cleave demonstration of gap junction between skeletal myogenic cells of vivo // Develop. Biol. 1974. Vol. 36. P. 455-461.

-- Ravazzola M. Intercellular junctions in rat parathyroid gland: a freeze-fracture study // Experientia. 1977. Vol. 33. P. 828.

-- Raviola E., Gilula N. Gap junctions between photoreceptor cells in vertebrate retina // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. P. 1677-1681.

-- Raviola E., Raviola G. Structure of the synaptic membranes in the inner, plexiform layer of the retina: a freeze-fracture study in monkeys and rabbits//J. Сотр. Neurol. 1982. Vol. 209. P. 233-248.

-- Raviola G., Raviola E. Intercellular junctions in the ciliary epithelium // Invest. Ophtal-mol. Visual Sci. 1978. Vol. 17. P. 958-981.

-- Reale E., Benezzo F., RuggeriA. Differences in the microfibrillar arrangement of collagen fibrils. Distribution and possible significance//J. Submicrosc. Cytol. 1981. Vol 13 P. 135-143.

-- Reger J., Faln-Maurel M., Dadoune J.-P. A freeze-fracture study on epididymal and ejaculate spermatozoa of the monkey (Macaca fascicularis) //J. Submicrosc. Cytol. 1985. Vol. 17. P. 49-56.

-- Renar-Piqueras J. Morphological differences in human peripheral blood lymphocyte. A freeze-etching and SEM study//Acta haematol. 1978. Vol. 59. P. 19-24.

-- Revel J.-P. Gap junctions in development // Amer. Zool. 1986. Vol. 26. P. 529-533.

-- Revel J.-P., Karnovskl M. Hexagonal array of subunits in intercellular junctions of the mouse heart and liver//J. Cell Biol. 1967. Vol. 33. P. C7-C12.

-- Ribeiro A., Ferronha M., David-Ferrelra J. Freeze-fracture study of the hamster ovary surface epithelium intercellular junctions// J. Submicrosc. Cytol. 1983. Vol. 15. P. 415- 423.

-- Rlgler M., Ferrelra G., Ration J. Intramembranous particles are clustered on microvillus membrane vesicles // Biochim. biophys. acta : Biomembranes. 1985. Vol. 816(M129). P. 131 - 141.

-- Robards A., Bald W. Supercritical nitrogen - the optimum coolant for cryofixation // J. Electron. Microsc. 1986. Vol. 35. P. 2215- 2216.

-- Robenek H., Gebhardt R., Jung W. Freeze-fracture identification of complexes between cholesterol and filipin, digitonin or tomatin in hepatocyte plasma membrane during formation of the biliary pole // Electron Microsc. 1982 : 10th Intern. Congr. Frank-furt/M., 1982. P. 457-458.

-- Robenek H., Herwig J., Thetnann H. The morphologic characteristics of intercellular junctions between normal human liver cells and cell from patients with extrahepatic cholestasis //Amer. J. Pathol. 1980. Vol. 100. P. 93-114.

-- Robertson J. New observation on the ultra-structure of frog peripheral nerve fibers // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1957. Vol. 3. P. 1043-1048.

-- Robinson J., Karnovski M. Evaluation of the polyene antibiotic filipin as a cytochemical probe for membrane cholesterol // J. Histo-chem. Cytochem. 1980. Vol. 28. P. 161 - 168.

-- Robinson J., Karnovsky M. Specializations in filopodial membranes at points attachment to the substrate // J. Cell. Biol. 1980. Vol. 87. P. 562-568.

-- Rodewald R., Newman S., Karnovsky M. Contraction of isolated brush border from the intestinal epithelium//J. Cell Biol. 1976. Vol. 70. P. 541-554.

-- Rohlich P. A simple freeze-fracturing and etching apparatus using the cold block principle//Acta biol. Acad. sci. hung. 1980. Vol. 31. P. 257-271.

-- Rohlich P., Allison A. Oriented pattern of membrane-associated vesicles in fibroblasts//J. Ultrastruct. Res. 1976. Vol. 57. P. 94-103.

-- Rosenbluth J. Freeze-fracture studies of nerve fibers: evidence that regional differentiation of the axolemma depends upon glial contact//Current topics of nerve and muscle research. Amsterdam; Oxford, 1979. P. 200-209.

-- RuggeriA., Reale E., StrocchiR., Benazzo F. On the microfibrillar organization of the collagen fibrills//Anat. Anz. 1981. Vol. 150. P. 145-146.

-- Ryerse J., Nagel В., Hammel I. The role of connexon aggregate fusion in gap junction growth // J. Submicrosc. Cytol. 1984. Vol. 16. P. 649-657.

-- Sakagami M., Matsunaga Т., Hashimoto P. Fine structure and permeability of capillaries in the stria vascularis and spiral ligament of the inner ear of the guinea pig//Cell Tissue Res. 1982. Vol. 226. P. 511-522.

-- Sasaki Т., Higashi S., Tachikawa Т., Yoshiki S. Thin-section, tracer, and freeze-fracture study of the smooth-ended maturation ameloblasts in rat incisors //Acta anat. 1983. Vol. 117. P. 303-313.

-- Satir В., Satir P. Partitioning intramembrane particles during the freeze-fracture procedure//Freeze fracture : Artifacts and interpretations / Eds. J. Rash, C. Hudson. New York, 1979. P. 43-49.

-- Satir В., Schooley C., Satir P. Membrane fusion in a model system. Mucocyst secretion in Terachynema //J. Cell. Biol. 1973. Vol. 56. P. 153-176.

-- Schiller A., Rix E., Taugner R. Freeze-fracture autoradiography: the vacuo coating technique//Histochemistry. 1978. Vol. 59. P. 9-16.

-- Schliwa M. The cytoskeleton. An intraduc-tory survey. Wien; New York, 1986. 326 p.

-- Schnaitman C. Comparison of rat liver mitochondrial and microsomal membrane proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1969. Vol. 63. P. 418-419.

-- Schnapp В., Mugnaini E. Membrane architecture of myelinated fibers as seen by freeze-fracture // Physiology and pathotology of axons / Ed. S. Waxman. New York, 1978. P. 83-123.

-- Schneeberger E. Structural basis for some permeability properties of the air-blood barrier // Fed. Proc. 1978. Vol. 37. P. 2471 - 2478.

-- Schneeberger E. Heterogeneity of tight junction morphology in extrapulmonary airways of the rat//Anat. Rec. 1980. Vol. 198. P. 193-208.

-- Schneeberger E., McCormack S. Intercellular junctions in upper airway submucosal glands of the rat: a tracer and freeze-fracture study //Anat. Rec. 1984. Vol. 210. P. 421 - 433.

-- Schneider-Picard G., Carpentier J., Orci L. Quantitative evaluation of gap junctions during development of the brown adipose tissue // J. Lipid Res. 1980. Vol. 21. P. 600- 607.

-- Schwartz S. Dynamic maintenance of the endothelium//The endothelial pluripotent control cell of the vessel wall. Basel, 1983. P. 113-125.

-- Senda Т., Fujita H. Ultrastructural aspects of quick-freezing beep-etching replica images of the cytoskeletal system in anterior pituitary secretory cells of rats and mice//Arch. Histol. Jap. 1987. Vol. 50. P. 49-60.

-- Setoguti Т., /поие V. Freeze-fracture study of the rat parathyroid gland hypo- and hyper-calcemic conditions, with special reference to secretory granules // Cell Tissue Res. 1983. Vol. 228. P. 219-230.

-- Severs N. Ultrastructural localization of lipids in heart cell membranes //J. Mol. Cell Cardiol. 1983. Vol. 15. P. 20.

-- Severs N. Intercellular junctions and the cardiac intercalated disk//Advans in myo-cardiology. New York; London, 1985. Vol. 5. P. 223-242.

-- Severs N., Robenek H. Detection of micro-domains in biomembranes: an appraisal of recent development in freeze-fracture cytochemistry//Biochim. biophys. acta. 1983. Vol. 737. P. 373-408.

-- Severs N., Simons H. Lack of cytochemically detectable cholesterol in rabbit vena cava endothelial plasma membrane//J. Anat. 1987. Vol. 151. P. 233-248.

-- Shafiq S., Leung В., Schutta H. A freeze-fracture study of fiber types in normal human muscle//J. Neurol. 1979. Vol. 42. P. 129- 138.

-- Shaklai M., Tavassoli AL Endothelial cell membrane. Differences in the density of inter-membranous particles between tissue and blood fronts revealed by freeze-fracture// Amer. J. Anat. 1978. Vol. 151. P. 139- 144.

-- Sheffield J. Studies on aggregation of embryonic cells: initial cell adhesion and the formation of intercellular junction // J. Mor-phol. 1970. Vol. 132. P. 245-262.

-- Sheridan J. Dye movement and low resistance junctions between reaggregated embryonic cells // Develop. Biol. 1971. Vol. 26. P. 627- 636.

-- Sheridan 1. The cell surface in development // The cell surface in animal embryo-genesis and development / Eds. G. Foste, G. Nicolson. New York, 1976. P. 409-449.

-- Sheridan I. Dye transfer in small vessels from the omentum: homologus and heterologus junctions//J. Cell Biol. 1980. Vol. 87. P. 61a.

-- Shibata Y., Izumi Т., Yamamoto T. Upside-down etching. A simple method for reducing unetchable sediment during deep-etching of fresh untreated tissues // J. Microsc. (Gr. Brit.). 1987. Vol. 148. P. 97-101.

-- Shibata Y., Nakata K., Page E. Ultrastructural changes during development of gap junctions in rabbit left ventricular myocardial cells//J. Ultrastruct. Res. 1980. Vol. 71. P. 258-271.

-- Shibata Y., Yamamoto ,T. Cytoplasmic surface ultrastructures of cardiac gap junctions as revealed by quick-freeze, deep-etch replicas // Anat. Rec. 1986. Vol. 214. P. 107-112.

-- Shimono AL, Clementi F. Intercellular junctions of oral epithelium. 1. Studies with freeze-fracture and tracing methods of normal rat keratinized oral epithelium//J. Ultrastruct. Res. 1976. Vol. 56. P. 121 - 136.

-- Shimono M., Nishihara Ymamura T. Intercellular junctions in developing rat submandibular glands. 1. Tight junctions// J. Electron Microsc. 1981. Vol. 30. P. 29-45.

-- Shimono AL, Yamamura Т., Fumagalli G. Intercellular junctions in salivary glands: freeze-fracture and tracer studies of normal rat sublingual gland//J. Ultrastruct. Res. 1980. Vol. 72. P. 289-299.

-- Shotton D. Freeze-fracture view of membrane fusion // Nature. 1978. Vol. 272. P. 16- 17.

-- Shotton D. Quantitative freeze-fracture electron microscopy of dystrophic muscle membranes // J. Neurol. Sci. 1982. Vol. 57. P. 161 - 190.

-- Shotton D., Thompson K., Wofsy L., Branton D. Appearance and distribution of surface proteins of the human erythricyte membranes//J. Cell Biol. 1977. Vol. 76. P. 512- 531.

-- Sikerwar S., Malhotra S. A structural characterization of gap junctions isolated from mouse liver//Cell Biol. Intern. Repts. 1983. Vol. 7. P. 897-903.

-- Simionescu AL, Simionescu N. Organization of cell junction in the peritoneal meso-thelium //J. Cell Biol. 1977. Vol. 74. P. 98- 110.

-- Simonescu AL, Simionescu N., Palade G. Morphometric data on the endothelium of blood capillaries // J. Cell Biol. 1974. Vol. 60. P. 128-152.

-- Simonescu AL, Simionescu N., Palade G. Segmental differentations of cell junctions in vascular edothelium. The microvascula-ture // J. Cell Biol. 1975. Vol. 67. P. 863-885.

-- Simionescu AL, Simionescu N.. Palade G. Characteristic endothelial junctions in different segments of the vascular system// Thromb. Res. 1976. Vol. 8. P. 247-256.

-- Simionescu AL, Simionescu N., Palage G. Different microdomains on capillary endothelium. 1. Preferential distribution of anionic sites //J. Cell Biol. 1981. Vol. 90. P. 605- 613.

-- Simionescu N., Lupu F., Simionescu M. Rings of membrane sterols surround openings of vesicles and fenestrae in capillary endothelium // J. Cell Biol. 1983. Vol. 97. P. 1592- 1600.

-- Simson J., Bank H. Freeze-fracture and lead ion tracer evidence for a paracellular fluid secretory pathway in rat parotid glands // Anat. Res. 1984. Vol. 208. P. 69-80.

-- Singer S. Ultastructure of biological membrane II J. Amer. Rev. Biochem. 1974. Vol. 43. P. 805.

-- Singer S. The fibronexus: transmembrane association of fibronectin-containing fibers and bundles of 5 nm microfilaments in hamsters and human fibroblasts // Cell. 1979. Vol. 16. P. 675-685.

-- Singer S., Morrison M. Circular dichroism of human erythrocyte membrane subilized by N-pentanol // Biochem. biophys. acta. 1972. Vol. 274. P. 64-70.

-- Singer S., Nicolson G. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes are viewed as two dimensional solutions of oriented globular proteins and lipids // Science. 1972. Vol. 175. P. 16-27.

-- SinhaA., Bentley M., Pomroy F., Jamuar M. Freeze-fracture, ultrastuctural and autoradiographic analysis of the ventral prostate glands in castrated mice//Cell Tissue Res. 1981. Vol. 215. P. 547-561.

-- Sjdstrand F. The ultrastructure of cells as revealed by electron microscope // Intern. Rev. Cytol. 1956. Vol. 5. P. 455-483.

-- Sjdstrand F. New ultrastructure elements of the membranes // J. Ultrastruct. Res. 1963. Vol. 9. P. 340-361.

-- Sjdstrand F., Cassell R. Structure of inner membrane in rat heart muscle mitochondria as revealed by means of freeze-fracturing // J. Ultrastruct. Res. 1978. Vol. 63. P. Ill - 137.

-- Sjdstrand F., Cassell R. The structure of the surface membranes in heart muscle mitochondria as revealed by freeze-fracturing // J. Ultrastruct. Res. 1978. Vol. 63. P. 138-154.

-- Sjdstrand F., Kreman M., Crescltelli F. Freeze-fracture analysis of photoreceptor cell outer segment disks after minimal extraction of rhodopsin // J. Ultrastruct. Res. 1979. Vol. 69. P. 53-67.

-- Skaer R. J., Emmines J. P., Skaer H. The fine structure of cell contacts in platelet aggregation // J. Ultrastruct. Res. 1979. Vol. 69. P. 28-42.

-- Skerrow C. J., Matolzsy A. G. Chemical characterization of isolated epidermal desmo-somes //J. Cell Biol. 1974. Vol. 63. P. 524- 530.

-- Sleytr V. В., Robards A. W. Plastic deformation during freeze-cleavage: a review // J. Microsc. 1977. Vol. 110. P. 1-25.

-- Sleytr U. В., Robards A. W. Freeze-fracturing: a review of methods and results // J. Microsc. 1977. Vol. 111. P. 77-100.

-- Sleytr U. В.. Robards A. W. Understanding the artifact problem in freeze-fracture replication: a review //J. Microsc. 1982. Vol. 126. P. 101 - 122.

-- SobellJ. S., Opas M., Kalnlns V. Y. Spectrin and cell contacts in the early mouse embryo // J. Cell Biol. 1985. Vol. 101. P. 468-472.

-- Sommer J. R.. Dolber P. C, Taylor I. Filipin-cholesterol complexes in the sarcoplasmic reticulum of frog skeletal muscle // J. Ultrastruct. Res. 1980. Vol. 72. P. 272-280.

-- Sotelo С, Кот H. Morphological correlates of electrical and other interactions through low-resistance pathways between neurons of the vertebrate central nervous system // Intern. Rev. Cytol. 1978. Vol. 55. P. 67-107.

-- Spagnoli L. V., Pietra G. G., Villaschi S., Johns L. W. Morphometric analysis of gap junctions in regenerating arterial endothelium //Lab. Invest. 1982. Vol. 46. P. 139-148.

-- Spies ё., Elbers P. F., Llnnemans W. A. M. Induced cell adhesion in Entamoeba castel-lani // Cytobiology. 1972. Vol. 6. P. 327- 331.

-- Staehelln L. A. Further observations on the fine structure of freeze cleaved tight junction //J. Cell Sci. 1973. Vol. 13. P. 763- 786.

-- Staehelin L. A. Structure and function of intercellular junctions // Intern. Rev. Cytol. 1974. Vol. 39. P. 191-284.

-- Steer R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens // J. Biochem. Cytol. 1957. Vol. 3. P. 45-60.

-- Stempak L. G., Laurencin M. High resolution of intracellular membranes // J. Microsc. 1970. Vol. 9. P. 465-476.

-- Stetson J. W. Freeze-fracture of membrane tubular cells of the rat kidneys // Kidney Intern. 1980. Vol. 17. P. 45-56.

-- Stoeckenius W. Some electron microscopical observations on liquid-crystalline phases in lipid-water systems//J. Cell Biol. 1962. Vol. 12. P. 221-229.

-- Stoeckenius W., Engelman D. Current models for the structure of biological membranes // J. Cell Biol. 1969. Vol. 42. P. 613-646.

-- Stoeckenius W., Kunan W. H. Further characterization of particular fractions from lysed cell envelopes of Halobacterium halo-bium and isolation of gels vacuole membranes//J. Cell Biol. 1968. Vol. 38. P. 337- 342.

-- Stolinskl C, Breathnach A. S. Freeze-fracture replication and surface sublimation of frozen collagen fibrils//J. Cell Sci. 1977. Vol. 23. P. 325-334.

-- Structure and properties of cell membrane / Ed. G. Benga. Boca Raten (Fl), 1985. 280 p.

-- Surchev L. K. Freeze-etch evidence for the existence of neuronal gap junctions in the visual cortex //Докл. Болг. АН. 1986. Т. 39. С. 133 - 135.

-- Suzuki F., Nagano Т. Regional differentiation of cell junctions in the excurrent duct epithelium of the testis as revealed by freeze-fracture // Anat. Rec. 1978. Vol. 191. P. 503- 519.

-- Suzuki F., Nagano T. Comparative aspects of intramembranous particle distribution changes in the sperm plasma membrane during the passage through the epididymis // J. Electron Microsc. 1986. Vol. 35. P. 2973- 2974.

-- Tabata S., Semba T. Examination of blood capillaries in rat incisor pulp by ТЕМ of thin sections and freeze-fracture replicas // J. Electron Microsc. 1987. Vol. 36. P. 283-293.

-- Tachibana M., Marioka H. Membranous cochlea as revealed by freeze-fracture method//J. Electron. Microsc. 1976. Vol. 25. P. 213-217.

-- Taira K., Aoki Т., Shibasaki S A freeze-fracture study of the plasma membrane of the Ito cell in the normal liver of rat // Arch. Hi-stol. Jap. 1987. Vol. 50. P. 95-102.

-- Tani E., Yamagata S., Ito Y. Cell membrane structure of vacular smooth muscle of circle of Willis//Cell Tissue Res. 1977. Vol. 179. P. 131 - 142.

-- Taugner R., Sonnhof U., Richter D. W., Schiller A. Mixed (chemical and electrical) synapses on frog spinal motoneurons // Cell Tissue Res. 1978. Vol. 193. P. 41-59.

-- Tavassoli AL, Shaklai AL Absence of tight junctions in endothelium of marrow sinuses: possible significance for marrow cell egress // Brit. J. Haematol. 1979. Vol. 41. P. 303- 307

-- Teillet M. A., Hugon I. S., Calvert R. The occluding junctions of mouse duodenal entero-cytes during development - freeze-fracture study //Cell Tissue Res. 1981. Vol. 217. P. 65-77.

-- Thiele J. The human parathyroid chief cell a model for a polypeptide hormone producing endocrine unit as revealed by various functional and pathological conditions. A thin section and freeze-fracture study//J. Submicrosc. Cvtol. 1986. Vol. 18. P. 205-220.

-- Thiele J., Reale E. Freeze-fracture study of the junctional complex of human and thyroid follicles//Cell Tissue Res. 1976. Vol. 168. P. 133-140.

-- Tice L. W., Carter R. L., Cahill AL C. Tracer and fracture observations on developing tight junctions in fetal rat thyroid // Tissue Cell. 1977. Vol. 9. P. 395-417.

-- Tillack T. W., Scott R. E., Marchesi V. T. Structure of erythorocyte membrane studied by freeze-etching. 3. Localization of receptors for phytohemagglutinin and influence virus to the intramembranous particles//J. Exp. Med. 1972. Vol. 135. P. 1209-1227.

-- Tilney L. C, Mooseker AL S. Actin filament-membrane attachment are membrane particles involved//J. Cell Biol. 1976. Vol. 71. P. 402-416.

-- Tlng-Beal H., Montezano I., Moor H. Experiments with freeze-fracturing // Jap. J. Histol. 1986. Vol. 34. P. 345-348.

-- Torrisi M. R., Pavan A., Lotti L. V., Prati L. What germ agglutinin fracture-label of lymphocyte plasma and intracellular membranes // J. Electron Microsc. Techn. 1986. Vol. 4. P. 41-46.

-- Toshimori K... Higashi R., Oura C. Quantitative analysis of zonulae occludentes between oviductal epithelial cells at diestrous and estrous stages in the mouse: freeze-fracture study//Anat. Rec. 1983. Vol. 206. P. 257- 266.

-- Traub O., Dermietzel R., Leibstein A. et al. Gap junctions in several mouse tissues share antigenic determinants with mouse liver gap junctions // Hoppe-Seyler's Ztschr. physiol. Chem. 1984. Bd 365. S. 1072.

-- Unwin P. N. Т., Zampighi G. Structure of the junction between communicating cells // Nature. 1980. Vol. 283. P. 545-549.

-- Van den Haef M. H. F., Btuemink /. G., De Laat S. W. Gap junction and rhombic particle arrays in the freeze-fractured mouse oocyte-follicle cell complex // Europ. J. Cell Biol. 1984. Vol. 35. P. 312-316.

-- Van Deurs B. Rotary replication of rapidly frozen cell junction//J. Ultrastruct. Res. 1980. Vol. 73. P. 94.

-- Van Deurs В., Behnke O. Membrane structure of nonactivated and activated human blood platelets as revealed by freeze-fracture. Evidence for particle redistribution during platelet contraction//J. Cell Biol. 1980. Vol. 87. P. 209-218.

-- Van Deurs В., Kochler K. light junctions in the choroid plexus epithelium. A freeze-fracture study including complementary replicas // J. Cell Biol. 1979. Vol. 80. P. 662-673.

-- Van Deurs В.. Lujt J. H. Effects of glutaral-dehyde fixation on the structure of tight junctions. A quantitative freeze-fracture analysis // J. Ultrastruct. Res. 1979. Vol. 68. P. 160-172.

-- Van Meer G., Fuller S. D., Simons K. Sorting of (glyco-) lipids in epithelial cells possible implication for tight junction structure // Protein transport and secretion. Cold Spring Harbor (New York), 1985. P. 179- 183.

-- Van Meer., Simons K. The function of tight junction in maintaining difference in lipid composition between the apical basolateral cell surface domains of MDCK cells // EMBO J. 1986. Vol. 5. P. 1455-1464.

-- Vanderkooi G., Green D. Biological membrane structure. 1. The protein crystal model for membrane //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1970. Vol. 68. P. 615-621.

-- Verkteij A. J. Lipidic intramembranous particles // Biochim. biophys. acta. 1984. Vol. 779. P. 43-63.

-- Verkteij A. J. The nature of intramembranous particles // Physical methods in biological membranes and model systems. New York, 1985. P. 73-80.

-- Verkteij A. J., Ververgeart P. H. J. The architecture of biological and artificial membrane as visualized freeze-etching//Ann. Rev. Phys. Chem. 1975. Vol. 26. P. 101 - 122.

-- Verkleij A. J., Ververgeart P. H. J. Freeze-fracture morphology of biological membranes // Biochim. biophys. acta. 1978. Vol. 513. P. 303-327.

-- Vial J. D., Simun F. R., Mackinucn A. M. Effect of bile duct ligation on the ultrastructural morphogy of hepatocytes // Gastroenterology. 1976. Vol. 70. P. 85-92.

-- Voss Ch., Schiller A.. Taugner R. Morphology and distribution of the synapses to the motoneuron of the frog with the special reference to the subsurface cisterns // Cell Tissue Res. 1980. Vol. 213. P. 253-271.

-- Wade J. B. Hormonal modulation of epithelial atructure // Current topics in membrane and transport. Vol. 13. Cellular mechanism of renal tubular ion transport / Ed. E. L. Boulpaep. New York; London, 1978. P. 25-86.

-- Wade J. В., Kachadorian W. A., Di Sea-la V. A. Freeze-fracture electron microscopy: relationship of membrane structural features to transport physiology//Amer. J. Physiol. 1977. Vol. 232. P. 777-783.

-- Wade J. В., Karnovsky M. J. The structure of zonula occludens // J. Cell Biol. 1972. Vol. 60. P. 168-180.

-- Wade J. В., Karnovsky M. L. Fracture faces of osmotically disrupted zonulae occludentes // J. Cell Biol. 1974. Vol. 62. P. 344-350.

-- Walker D. C, Mac Kenzie A., Hubbert W. C, Hogg J. C. A re-assessment of the tricellular region of epithelial ceil tight junction in trachea of guinea pig // Acta anat. 1985. Vol. 122. P. 35-38.

-- Wallach D. F. H., Gordon A. S. Lipid-protein interactions in cellular membranes // Regulatory function of biological membrane. Amsterdam etc., 1968. P. 87-98.

-- Warshawsky H. A freeze-fracture of the topographic relationship between inner enamel-secretory ameloblasts in the rat incisor // Amer. J. Anat. 1978. Vol. 152. P. 153-207.

-- Warshawsky H., Jesephsen K., Thylstrup A., Fejerskov O. The development of enamel structure in the rat incisors as compared to the teeth of monkey and man //Anat. Rec. 1981. Vol. 200. P. 371.

-- Weinstein R., Zel G., Merk F. B. Quantitation of occludens, adherens and nexus cell junction in human tumors // Miami Winter Symp. 1974. Vol. 8. P. 127-150.

-- White J. A., Ctawson С. C. The surface connected canalicular system of blood platelets- a fenestrated membrane system// Amer. J. Pathol. 1980. Vol. 101. P. 353-364.

-- Wilklns M. N. F. Structure of frog photoreceptor membranes // Nature. 1969. Vol. 223. P. 206-209.

-- Willison J. H. M., Rajaraman R. "Large" and "small" nuclear pore complexes: the influence of glutaraldehyde //J. Microscopy. 1977. Vol. 109. P. 183-192.

-- Winterhager E., Brommer F., Denker H. W. Gap junction formation in the uterine epithelium in respons to embryo recognition // Europ. J. Cell Biol. 1985. Vol. 36. Suppl. P. 74.

-- Winterhager ё., Busch L. G., Kuhnel W. Membrane events involved in fusion of uterine epithelial cells in pseudopregnant rabbits // Cell Tissue Res. 1984. Vol. 235. P. 357-363.

-- Winterhager E., Mendoza A. Structure of quick-frozen tight junctions in uterine epithelium pseudopregnant rabbits // Ztschr. mikrosc.-anat. Forsch. 1987. Bd 101. S. 179-185.

-- Wissig S. L., Williams M. C. Permeability of mucle capillaries to microperoxidase// J. Cell Biol. 1978. Vol. 76. P. 341-359.

-- Writkovsky P., Owen W. G., Woodworth M. Gap junction among the perikarya, dendrites and axon terminals of the luminosity-type horizontale cell of the turtle retina // J. Сотр. Neural. 1983. Vol. 216. P. 359-368.

-- Wunderlich F., Wallach D. F., Speth V., Fischer H. Differential effects of temperature on the nuclear and plasma membrane of lymphoid cells. A study by freeze-etch electron microscopy//Biochim. biophys. acta. 1974. Vol. 373. P. 34-43.

-- YeeA. G., Revel J. P. Loss and reappearence of gap junctions in regenerating liver // J. Cell Biol. 1978. Vol. 78. P. 554-564.

-- Zampighi G. A., Simon S. A. The structure of gap junctions as revealed by electron microscopy // Gap junctions Proc. Conf. Cold Spring Harbor (New York), 1985. P. 13-22.

--


ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Список принятых сокращений


## Глава 1. Физические основы замораживания


Замораживание

Криопротекторы


## Глава 2. Методические аспекты. Интерпретация изображений


Этапы препарирования

Общие вопросы анализа изображений

Цитохимический анализ


## Глава 3. Артефакты


## Глава 4. Клеточные мембраны. Принципы организации


Модель Даниелли-Давсона-Робертсона

Липид-белковые взаимодействия в мембране

Субъединичные модели и глобулярная организация клеточных мембран

Жидкостно-мозаичная модель клеточной мембраны

Анализ мембранных структур методом ЗСТ


## Глава 5. Мембраны клеточных органоидов. Цитоскелет


Слияние мембран

Специализированные участки плазматической мембраны

Ядро

Митохондрии, цитоплазматическая сеть, пластинчатый комплекс (Гольджи)

Цитоскелет


## Глава 6. Межклеточные контакты. Структурно-функциональная организация


Плотный контакт

Септированный контакт

Промежуточный контакт

Десмосомы

Щелевой контакт


## Глава 7. Клеточные мембраны различных тканей. Элементы экстрацеллюлярного матрикса


Эпителиальные ткани

Соединительные ткани

Мышечная ткань

Нервная ткань


## Глава 8. Структурно-функциональная организация клеточных мембран в некоторых органах


Органы чувств

Кровеносные и лимфатические сосуды. Эндотелий

Железы внутренней секреции

Органы кроветворения и иммунитета

Органы пищеварения

Органы дыхания

Органы выделения

Мужская половая система

Женская половая система

Заключение

Литература

CONTENTS

Introduction

List of abbreviations

Chapter 1. Physical basis of freezing

Freezing

Cryoprotectants

Chapter 2. Methods. The interpretation of images

Preparation procedures

The general problems of the image analysis

Cytochemical analysis

Chapter 3. Artifacts

Chapter 4. Cell membranes. The principles of the organization

Danielli-Davson-Robertson model of membrane structure

Lipid-protein interaction in membrane

Subunit models and globular organization of cell membranes

Fluid-mosaic model of the structure of the cell membranes

Analysis of membrane structure by freeze-fracturing-etching methods

Chapter 5. Membranes of the cell organoids. Cytoskeleton

Membrane fusion

Specialized regions of plasma membrane

Nucleus

Mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi complex

Cytoskeleton

Chapter 6. Intercellular junctions. Structural and functional organization

Tight junction

Septate junction

Intermediate junction

Desmosomes

Gap junction

Chapter 7. Cell membranes in different tissues. Extracellular matrix

Epithelium

Connective tissue

Muscles

Nerves

Chapter 8. Structural and functional organization of cell membranes in different organs

Sense organs

Blood and lympha vessels. Endothelium

Endocrine glands

Blood-making and immune organs

Digestive organs

Respirative organs

Eliminative organs

Masculine genital system

Feminine genital system

Conclusion

References


Научное издание


Ян Юдович Комиссарчик, Александр Александрович Миронов

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ: замораживание-скалывание-травление


Утверждено к печати

Институтом цитологии Академии наук СССР


Редактор издательства Л. С. Евстигнеева Художник Л. А. Яценко Технический редактор О. Б. Мацылевич Корректоры Г. Н. Мартьянова и Н. В. Романенкова

ИБ N 44078

Сдано в набор 08.08.89. Подписано к печати 04.01.90. М-18003. Формат 70Х1001/16. Бумага офсетная N 1. Гарнитура литературная. Фотонабор. Печать офсетная. Усл. печ. л. 11.7+2.6 вкл. Усл. кр.-отт. 14.63. Уч.-изд. л. 17.54. Тираж 1200. Тип. зак. N 1860. Цена 3 р. 60 к.

Ордена Трудового Красного Знамени издательство "Наука". Ленинградское отделение. 199034, Ленинград, В-34, Менделеевская линия, 1

Ордена Трудового Красного Знамени Первая типография издательства "Наука". 199034, Ленинград, В-34, 9 линия, 12.


10


39


108


174


188


210